Summary

مقايسة الملكيت الأخضر لاكتشاف مثبطات بروتين الصدمة الحرارية 90

Published: January 20, 2023
doi:

Summary

بروتوكول الفحص الأخضر الملكيت هو طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة لاكتشاف مثبطات بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) ، بالإضافة إلى مركبات مثبطة أخرى ضد الإنزيمات المعتمدة على ATP.

Abstract

بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) هو هدف واعد مضاد للسرطان بسبب تأثيره المرافقة على العديد من البروتينات المسرطنة. يعتمد نشاط Hsp90 على قدرته على تحلل أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) إلى أدينوسين ثنائي الفوسفات (ADP) والفوسفات الحر. يرتبط نشاط ATPase ل Hsp90 بوظيفة المرافقة الخاصة به. يرتبط ATP بالمجال N-terminal ل Hsp90 ، وقد وجد أن تعطيل ارتباطه هو الإستراتيجية الأكثر نجاحا في قمع وظيفة Hsp90. يمكن قياس نشاط ATPase بواسطة مقايسة خضراء من الملكيت اللوني ، والتي تحدد كمية الفوسفات الحر التي يشكلها التحلل المائي ATP. هنا ، يتم وصف إجراء لتحديد نشاط ATPase للخميرة Hsp90 باستخدام مجموعة مقايسة الفوسفات الأخضر الملكيت. علاوة على ذلك ، يتم توفير تعليمات مفصلة لاكتشاف مثبطات Hsp90 عن طريق تناول geldanamycin كمثبط أصلي. أخيرا ، تمت مناقشة تطبيق بروتوكول الفحص هذا من خلال الفحص عالي الإنتاجية (HTS) لجزيئات المثبطات ضد الخميرة Hsp90.

Introduction

بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) هو مرافق جزيئي يحافظ على استقرار البروتينات المسؤولة عن تطور السرطان وتطوره. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البروتينات المسؤولة عن تطوير مقاومة العوامل المضادة للأورام هي أيضا عملاء Hsp901. يتم التعبير عن Hsp90 بشكل مفرط في كل مكان في جميع أنواع الخلايا السرطانية (>90٪ من البروتينات الخلوية) ، مقارنة بالخلايا الطبيعية حيث قد تشكل أقل من 2٪ من إجمالي البروتينات. علاوة على ذلك ، فإن Hsp90 للخلايا السرطانية موجود في مجمع مع مرافقين مشتركين ، بينما في الخلية الطبيعية يكون موجودا في الغالب في حالة حرة غير معقدة 2,3. في السنوات الأخيرة ، ثبت أن العديد من مثبطات Hsp90 تمتلك تأثيرات senolytic في الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي ، حيث حسنت بشكل كبير من عمر الفئران4،5،6. تثبت جميع النتائج المذكورة أعلاه حقيقة أن مثبطات Hsp90 يمكن أن تكون فعالة في أنواع متعددة من السرطان ، مع آثار ضارة أقل وفرص أقل لتطوير المقاومة. يتم إنجاز وظيفة المرافقة ل Hsp90 عن طريق ربط ATP في المجال N-terminal ل Hsp90 وتحلله مائيا إلى ADP والفوسفاتالحر 7. تم العثور على جزيئات صغيرة ترتبط بشكل تنافسي بجيب ربط ATP ل Hsp90 لقمع تأثير مرافقة البروتين بنجاح. حتى الآن ، لا تزال هذه هي أفضل استراتيجية لتثبيط Hsp90 ، والتي تدعمها حقيقة أن هذه المثبطات قد وصلت إلى التجارب السريرية8. واحد منهم ، Pimitespib ، تمت الموافقة عليه في اليابان لعلاج ورم انسجة الجهاز الهضمي (GIST) في يونيو 20229. هذا هو أول مثبط Hsp90 تمت الموافقة عليه منذ أن تم إنشاء قابلية الدواء للمرافق في عام 199410.

اختبار الملكيت الأخضر هو إجراء بسيط وحساس وسريع وغير مكلف للكشف عن الفوسفات غير العضوي ، ومناسب للأتمتة والفحص عالي الإنتاجية (HTS) للمركبات مقابل الهدفالمطلوب 11. تم استخدام الفحص بنجاح لفحص مثبطات Hsp90 في إعدادات صغيرة على نطاق المختبر ، وكذلك في HTS12،13،14،15،16،17. يستخدم الفحص طريقة قياس لوني تحدد الفوسفات غير العضوي الحر المتكون بسبب نشاط ATPase ل Hsp90. أساس هذا القياس الكمي هو تكوين مركب فوسفومولبدات بين الفوسفات الحر والموليبدينوم ، والذي يتفاعل لاحقا مع الملكيت الأخضر لتوليد لون أخضر (الشكل 1). يتم قياس هذا التكوين السريع للألوان على مقياس الطيف الضوئي ، أو على قارئ الألواح ، بين 600-660 نانومتر18,19.

في البروتوكول الحالي ، يتم وصف الإجراء الخاص بإجراء مقايسة الملكيت الأخضر مع الخميرة Hsp90 والتحديد اللاحق للمثبطات ضد المرافق. تم أخذ جزيء المنتج الطبيعي ، geldanamycin (GA) ، الذي تم به إثبات قابلية استخدام Hsp90 لأول مرة ، كمثبط أصلي10. أصبحت HTS جزءا لا يتجزأ من برنامج اكتشاف الأدوية الحالي ، نظرا لتوافر عدد كبير من الجزيئات للاختبار. اكتسبت هذه التقنية أهمية أكبر في العامين الماضيين بسبب الحاجة الملحة لإعادة استخدام الأدوية لعلاج عدوى Covid-1920,21. لذلك ، يتم تقديم مخطط تفصيلي ل HTS للجزيئات ضد بروتين الخميرة Hsp90 من خلال اعتماد طريقة الفحص الأخضر الملكيت.

Protocol

1. مقايسة الملكيت الخضراء على نطاق المختبر إعداد مقايسة العازلةقم بإعداد مخزن الفحص المؤقت ، وفقا للتكوين والتحضير المعروضين في الجدول 1. إعداد معايير الفوسفاتاستخدم معيار فوسفات 1 مللي مول ، المقدم في مجموعة مقايسة فوسفات الملكيت الأخضر (المخز…

Representative Results

يتم تفسير نتائج الفحص من حيث الامتصاص بسبب تركيز أيونات الفوسفات الحرة. يعتبر الامتصاص بواسطة الفوسفات الحر بسبب التحلل المائي ATP بواسطة الخميرة Hsp90 عند 620 نانومتر نشاطا بنسبة 100٪ ATPase ، أو تثبيط البروتين بنسبة صفر. يؤدي تثبيط البروتين إلى وقف التحلل المائي ATP (فوسفات أقل حرية). وهو ما ينعكس م?…

Discussion

Hsp90 هو هدف مهم لاكتشاف جزيئات الأدوية الجديدة المضادة للسرطان. منذ تأسيس قابليتها للدواء في عام 199410 ، وصلت جزيئات 18 إلى التجارب السريرية. في الوقت الحاضر ، توجد سبعة جزيئات في مراحل مختلفة من التجارب السريرية ، إما بمفردها أو مجتمعة22. كل هذه الجزيئات الصغيرة هي مث?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من قبل برنامج زمالة كوريا البحثية (KRF) ، زميل ما بعد الدكتوراه في المؤسسة الوطنية للبحوث الكورية (NRF) ، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (NRF-2019H1D3A1A01102952). يعرب المؤلفون عن امتنانهم لمنحة KIST الداخلية ومنحة وزارة المحيطات ومصايد الأسماك رقم 2MRB130 لتقديم المساعدة المالية لهذا المشروع.

Materials

1M Magnesium chloride solution in water Sigma-Aldrich 63069-100ml
1M Potassium chloride solution in water Sigma-Aldrich 60142-100ml
96-well plate SPL Life Sciences Not applicable
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A7699-5G
Biomek FX laboratory automation workstation Beckman Coulter Not applicable
Compounds 3-96 Not applicable Not applicable Histidine tagged yeast Hsp90 was obtained from Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom, and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Details cannot be disclosed due to patent infringement issues.
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Geldanamycin, 99% (HPLC), powder AK Scientific, Inc. V2064
Invitroge UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water ThermoFisher Scientific 10977015
Malachite Green Phosphate Assay  Assay kit Sigma-Aldrich MAK307-1KT
Multi-Detection Microplate Reader Synergy HT Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Synergy HT multi-plate reader Biotek Instruments, Inc. Not applicable
Trizma hydrochloride buffer solution, pH7.4 Sigma-Aldrich 93313-1L
Yeast Hsp90 Not applicable Not applicable School of Life Sciences, University of Sussex, United Kingdom and protein was expressed in KIST Gangneung Institute of Natural Products. Primary Accession number: P02829

References

  1. Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
  2. Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: emerging mechanistic insights. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 11 (7), 515-528 (2010).
  3. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  4. Dutta Gupta, S., Pan, C. H. Recent update on discovery and development of Hsp90 inhibitors as senolytic agents. International Journal of Biological Macromolecules. 161, 1086-1098 (2020).
  5. Fuhrmann-Stroissnigg, H., et al. Identification of HSP90 inhibitors as a novel class of senolytics. Nature Communications. 8 (1), 422 (2017).
  6. Fuhrmann-Stroissnigg, H., Niedernhofer, L. J., Robbins, P. D. Hsp90 inhibitors as senolytic drugs to extend healthy aging. Cell Cycle. 17 (9), 1048-1055 (2018).
  7. Pearl, L. H., Prodromou, C. Structure and mechanism of the Hsp90 molecular chaperone machinery. Annual Review of Biochemistry. 75, 271-294 (2006).
  8. Park, H. -. K., et al. Unleashing the full potential of Hsp90 inhibitors as cancer therapeutics through simultaneous inactivation of Hsp90, Grp94, and TRAP1. Experimental & molecular medicine. 52 (1), 79-91 (2020).
  9. Hoy, S. M. Pimitespib: first approval. Drugs. 82 (13), 1413-1418 (2022).
  10. Whitesell, L., Mimnaugh, E. G., De Costa, B., Myers, C. E., Neckers, L. M. Inhibition of heat shock protein HSP90-pp60v-src heteroprotein complex formation by benzoquinone ansamycins: essential role for stress proteins in oncogenic transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (18), 8324-8328 (1994).
  11. Rowlands, M. G., et al. High-throughput screening assay for inhibitors of heat-shock protein 90 ATPase activity. Analytical Biochemistry. 327 (2), 176-183 (2004).
  12. Sheikha, G. A., Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Some sulfonamide drugs inhibit ATPase activity of heat shock protein 90: investigation by docking simulation and experimental validation. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry. 26 (5), 603-609 (2011).
  13. Al-Sha’er, M. A., Mansi, I., Hakooz, N. Docking and pharmacophore mapping of halogenated pyridinium derivatives on heat shock protein 90. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research. 7 (4), 103-112 (2015).
  14. Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Elaborate ligand-based modeling reveals new nanomolar heat shock protein 90α inhibitors. Journal of Chemical Information and Modeling. 50 (9), 1706-1723 (2010).
  15. Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Rational exploration of new pyridinium-based HSP90α inhibitors tailored to thiamine structure. Medicinal Chemistry Research. 21 (4), 487-510 (2012).
  16. Al-Sha’er, M. A., Taha, M. O. Application of docking-based comparative intermolecular contacts analysis to validate Hsp90α docking studies and subsequent in silico screening for inhibitors. Journal of Molecular Modeling. 18 (11), 4843-4863 (2012).
  17. Dutta Gupta, S., et al. 2,4-dihydroxy benzaldehyde derived Schiff bases as small molecule Hsp90 inhibitors: rational identification of a new anticancer lead. Bioorganic Chemistry. 59, 97-105 (2015).
  18. Feng, J., et al. An improved malachite green assay of phosphate: mechanism and application. Analytical Biochemistry. 409 (1), 144-149 (2011).
  19. Gupta, S. D., et al. Molecular docking study, synthesis and biological evaluation of Mannich bases as Hsp90 inhibitors. International Journal of Biological Macromolecules. 80, 253-259 (2015).
  20. Zhao, Y., et al. High-throughput screening identifies established drugs as SARS-CoV-2 PLpro inhibitors. Protein & Cell. 12 (11), 877-888 (2021).
  21. Giri, A. K., Ianevski, A. High-throughput screening for drug discovery targeting the cancer cell-microenvironment interactions in hematological cancers. Expert Opinion on Drug Discovery. 17 (2), 181-190 (2022).
  22. Mahapatra, D. K., et al. Heat shock protein 90 (Hsp90) inhibitory potentials of some chalcone compounds as novel anti-proliferative candidates. Advanced Studies in Experimental and Clinical. , 107-122 (2021).
  23. Jaeger, A. M., Whitesell, L. HSP90: enabler of cancer adaptation. Annual Review of Cancer Biology. 3, 275-297 (2019).
  24. Yang, S., Xiao, H., Cao, L. Recent advances in heat shock proteins in cancer diagnosis, prognosis, metabolism and treatment. Biomedicine & Pharmacotherapy. 142, 112074 (2021).
  25. Mishra, S. J., et al. The development of Hsp90β-selective inhibitors to overcome detriments associated with pan-Hsp90 inhibition. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (3), 1545-1557 (2021).
  26. Khandelwal, A., et al. Structure-guided design of an Hsp90beta N-terminal isoform-selective inhibitor. Nature Communications. 9 (1), 425 (2018).
  27. Wang, Y., Koay, Y. C., McAlpine, S. R. How selective are Hsp90 inhibitors for cancer cells over normal cells. ChemMedChem. 12 (5), 353-357 (2017).
  28. Panaretou, B., et al. ATP binding and hydrolysis are essential to the function of the Hsp90 molecular chaperone in vivo. The EMBO Journal. 17 (16), 4829-4836 (1998).
  29. Banerjee, M., Hatial, I., Keegan, B. M., Blagg, B. S. J. Assay design and development strategies for finding Hsp90 inhibitors and their role in human diseases. Pharmacology & Therapeutics. 221, 107747 (2021).
  30. Howes, R., et al. A fluorescence polarization assay for inhibitors of Hsp90. Analytical Biochemistry. 350 (2), 202-213 (2006).
  31. Opalińska, M., Jańska, H. AAA proteases: guardians of mitochondrial function and homeostasis. Cells. 7 (10), 163 (2018).
  32. Ambrose, A. J., Chapman, E. Function, therapeutic potential, and inhibition of Hsp70 chaperones. Journal of Medicinal Chemistry. 64 (11), 7060-7082 (2021).
  33. Cheng, I., Mikita, N., Fishovitz, J., Frase, H., Wintrode, P., Lee, I. Identification of a region in the N-terminus of Escherichia coli Lon that affects ATPase, substrate translocation and proteolytic activity. Journal of Molecular Biology. 418 (3-4), 208-225 (2012).

Play Video

Cite This Article
Gupta, S. D., Song, D., Lee, S., Lee, J. W., Park, J., Prodromou, C., Pan, C. Malachite Green Assay for the Discovery of Heat-Shock Protein 90 Inhibitors. J. Vis. Exp. (191), e64693, doi:10.3791/64693 (2023).

View Video