基于CRISPR的一步法黑腹果蝇内源性基因标记策略
Summary
在这里，我们提出了一种简化的果蝇内源性基因标记方案，该方案利用基于PCR的技术对成功的基因修饰进行无标记鉴定，从而促进了稳定的敲入系的开发。
Abstract
活细胞中蛋白质亚细胞定位、动力学和调控的研究已经随着允许标记内源性基因以产生荧光融合蛋白的技术的出现而发生了深刻的变化。这些方法使研究人员能够实时可视化蛋白质行为，从而为它们在细胞环境中的功能和相互作用提供有价值的见解。目前许多基因标记研究采用两步过程，其中在第一步中使用可见标记（例如眼睛颜色变化）来识别转基因生物，并在第二步中切除可见标记。在这里，我们提出了一种一步法方案，用于在 黑腹果蝇中进行精确和快速的内源性基因标记，从而可以筛选没有可见眼标记的工程系，与过去的方法相比具有显着优势。为了筛选成功的基因标记事件，我们采用基于PCR的技术，通过分析中腿的一小段来对个体果蝇进行基因分型。通过筛选标准的苍蝇随后用于生产稳定的种群。在这里，我们详细介绍了CRISPR编辑质粒的设计和构建，以及用于筛选和确认工程系的方法。总之，该协议显着提高了 果蝇 中内源性基因标记的效率，并能够研究体内细胞过程。
Introduction
荧光蛋白已成为可视化生物体内细胞中蛋白质定位、动力学和蛋白质-蛋白质相互作用的强大工具 1,2。用荧光蛋白标记内源性基因，可以对具有亚细胞分辨率的细胞过程进行长期实时成像。此外，与过表达和免疫染色方法相比，这些内源性基因标记技术具有多项优势。例如，蛋白质的过表达可能导致蛋白质错误折叠、非特异性蛋白质-蛋白质相互作用和错误定位3。迄今为止，研究人员已经能够为一些模式生物（例如出芽酵母）创建与荧光蛋白融合的大量内源性基因库，这些基因可以进行有效的同源重组4。在黑腹果蝇的情况下，已经设计了各种工具，如MiMICs5、基于转座子的增强子陷阱6和fosmids7来荧光标记基因。
基于 CRISPR-Cas9 的工具的开发使得在各种模式生物中有效地进行基因组编辑成为可能，包括标记内源性蛋白质 8,9。Cas9 是一种 RNA 引导的酶，它以高效和特异性的方式切割双链DNA8，然后可以通过非同源末端连接 （NHEJ） 通路进行修复，从而导致点突变或缺失。或者，同源定向修复 （HDR） 通路允许将异源 DNA 整合到染色体中。
过去在模式生物果蝇黑腹果蝇中基于CRISPR的基因标记方法依赖于两步过程10,11,12。这涉及使用可辨别的眼睛颜色标记 Dsred 来检测成功的 HDR 事件。之后，将使用 Cre/loxP 重组系统切除 Dsred 标记。为了简化和加快这一过程，在这里，我们提出了一种更简单、更有效的方法。这种方法避免了对致命基因分型的需要，并允许直接筛选单个果蝇。具体来说，我们采用基于PCR的方法从果蝇中腿的一小部分提取DNA，使我们能够对单个果蝇进行基因分型。值得注意的是，此过程不会损害采样苍蝇的活力、运动或繁殖能力。只有通过这种方法确定的适当个体才能进一步发展为稳定的种群。
在这里，我们提出了一个用于生成荧光蛋白标记果蝇的详细方案，其中内源性基因用荧光报告基因标记。该技术使用 CRISPR-Cas9 基因组编辑将任何所需的荧光团标签融合到内源性基因的 N 端或 C 端。下面，我们描述了gRNA质粒和供体质粒的设计和构建，选择CRISPR阳性果蝇的一步筛选策略，以及建立稳定细胞系的步骤。具体来说，我们描述了在C末端用荧光团标记内源性核心时钟 果蝇 基因 周期的策略。我们还简要描述了需要进行的对照实验，以确认标记的蛋白质是功能性的，以及实时成像技术，以可视化完整 果蝇 大脑中活时钟神经元中的周期蛋白13。这里描述的方案也广泛适用于通过CRISPR-Cas9基因组编辑筛选特定DNA片段的缺失和插入的候选者。
Protocol
Representative Results
Discussion
结果展示了一种简化的、简单的基于CRISPR的一步法策略，用于标记 果蝇的内源性基因。在方案中，我们使用两种gRNA来更有效地诱导DNA双链断裂和同源重组。将gRNA和供体质粒注射到果蝇胚胎中，果蝇胚胎在其种系中表达Cas9酶。这些胚胎随后在标准条件下培养直到成年，此时它们与平衡蝇杂交以产生第一代（F1）后代。对每个F1标本的中腿进行PCR基因分型，以筛选转基因果蝇。与目前使用两?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 George Watase 和 Josie Clowney 在协议制定的初始阶段进行的讨论。这项工作得到了美国国立卫生研究院（授予 R35GM133737 号 S.Y.）、Alfred P. Sloan 奖学金（授予 S.Y.）和麦克奈特学者奖（授予 S.Y.）的资金支持。
Materials
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987H | |
| 96-well deep well plate | BRAND | 701354 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A142-212 | |
| Prolong Glass Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36982 | |
| Proteinase K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila Medium | Gibco | 21720001 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
References
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