Одношаговая стратегия мечения эндогенных генов у Drosophila melanogaster на основе CRISPR
Summary
В данной работе мы представляем упрощенный протокол эндогенного мечения генов дрозофилы, в котором используется метод на основе ПЦР для безмаркерной идентификации успешных генетических модификаций, способствующий развитию стабильных линий knock-in.
Abstract
Изучение субклеточной локализации, динамики и регуляции белков в живых клетках претерпело глубокие изменения с появлением методов, позволяющих маркировать эндогенные гены для получения флуоресцентных белков слияния. Эти методы позволяют исследователям визуализировать поведение белков в режиме реального времени, предоставляя ценную информацию об их функциях и взаимодействиях в клеточной среде. Многие современные исследования по мечению генов используют двухступенчатый процесс, в котором видимые маркеры, такие как изменения цвета глаз, используются для идентификации генетически модифицированных организмов на первом этапе, а видимый маркер удаляется на втором этапе. Здесь мы представляем одноэтапный протокол для выполнения точной и быстрой эндогенной мечки генов у Drosophila melanogaster, который позволяет проводить скрининг инженерных линий без видимого маркера глаза, что дает значительное преимущество по сравнению с предыдущими методами. Для скрининга успешных событий генной мечки мы используем метод генотипирования отдельных мух на основе ПЦР, анализируя небольшой сегмент их средней ноги. Мухи, прошедшие отбор, затем используются для получения стабильных запасов. В этой статье мы подробно расскажем о проектировании и создании плазмид для редактирования CRISPR, а также о методах скрининга и подтверждения инженерных линий. В совокупности этот протокол значительно повышает эффективность эндогенного мечения генов у дрозофилы и позволяет изучать клеточные процессы in vivo.
Introduction
Флуоресцентные белки стали мощными инструментами для визуализации локализации, динамики и белок-белковых взаимодействий в клетках живых организмов 1,2. Мечение эндогенных генов флуоресцентными белками позволяет в течение длительного времени визуализировать клеточные процессы в реальном времени с субклеточным разрешением. Кроме того, эти эндогенные методы мечения генов имеют ряд преимуществ по сравнению с подходами к гиперэкспрессии и иммуноокрашиванию. Например, чрезмерная экспрессия белков может привести к неправильному сворачиванию белков, неспецифическим белок-белковым взаимодействиям и неправильной локализации3. На сегодняшний день исследователям удалось создать обширные библиотеки эндогенных генов, слитых с флуоресцентными белками для нескольких модельных организмов, таких как почковающиеся дрожжи, которые могут подвергаться эффективной гомологичнойрекомбинации. В случае с Drosophila melanogaster были разработаны различные инструменты, такие как MiMICs5, энхансерные ловушкина основе транспозонов 6 и fosmids7 для флуоресцентного мечения генов.
Разработка инструментов на основе CRISPR-Cas9 позволила эффективно выполнять редактирование генома, в том числе мечение эндогенных белков, в широком диапазоне модельных организмов 8,9. Cas9 представляет собой РНК-управляемый фермент, который расщепляет двухцепочечную ДНК высокоэффективным и специфичнымобразом8, которая затем может быть восстановлена с помощью негомологичного пути присоединения концов (NHEJ), приводящего к точечным мутациям или делециям. В качестве альтернативы, гомологический путь репарации (HDR) позволяет интегрировать гетерологичную ДНК в хромосому.
Прошлые методы мечения генов на основе CRISPR в модельном организме Drosophila melanogaster основывались на двухступенчатом процессе 10,11,12. Для этого используется различимый маркер цвета глаз Dsred для обнаружения успешных событий HDR. После этого маркер Dsred иссекался с помощью системы рекомбинации Cre/loxP. Чтобы упростить и ускорить этот процесс, мы представляем более простой и эффективный метод. Такой подход позволяет избежать необходимости в летальном генотипировании и позволяет проводить прямой скрининг отдельных мух. В частности, мы используем подход, основанный на ПЦР, для извлечения ДНК из небольшого сегмента средней ноги мухи, что позволяет нам генотипировать отдельных мух. Примечательно, что эта процедура не ставит под угрозу жизнеспособность, подвижность или репродуктивные возможности отобранной мухи. Только подходящие особи, выявленные с помощью этого метода, в дальнейшем развиваются в стабильные стаи.
Здесь мы представляем подробный протокол генерации мух, меченных флуоресцентными белками, у которых эндогенные гены помечены флуоресцентными репортерами. Этот метод использует редактирование генома CRISPR-Cas9 для слияния любой желаемой флуорофорной метки с N- или C-концом эндогенного гена. Ниже мы опишем проектирование и конструирование плазмид гРНК и плазмиды-донора, стратегию одноэтапного скрининга для отбора CRISPR-положительных мух и шаги по установлению стабильных линий. В частности, мы описываем стратегии маркировки эндогенных основных часов гена дрозофилы, и точка, с помощью флуорофора на С-конце. Мы также кратко описываем контрольные эксперименты, которые необходимо выполнить, чтобы подтвердить, что меченый белок является функциональным, и методы визуализации в реальном времени для визуализации белка Period в нейронах живых часов в интактном мозге дрозофилы 13. Протокол, описанный здесь, также широко применим для скрининга кандидатов на делеции и вставки определенных фрагментов ДНК путем редактирования генома CRISPR-Cas9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Результаты демонстрируют оптимизированную, простую одношаговую стратегию мечения эндогенных генов дрозофилы, основанную на CRISPR. В протоколе мы используем две гРНК для более эффективного индуцирования двухцепочечного разрыва ДНК и гомологичной рекомбинации. РНК и донорская пла?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Джорджа Ватасе и Джози Клоуни за дискуссии на начальных этапах разработки протокола. Работа была поддержана средствами NIH (грант No R35GM133737 для S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (для S.Y.) и McKnight Scholar Award (для S.Y.).
Materials
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987H | |
| 96-well deep well plate | BRAND | 701354 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A142-212 | |
| Prolong Glass Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36982 | |
| Proteinase K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila Medium | Gibco | 21720001 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
References
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
- Quinones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. 遗传学. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. Elife. 5, e12068 (2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. 遗传学. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kanca, O., et al. An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms. Elife. 8, e51539 (2019).
- Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9. Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).
- Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).
- Kanca, O., et al. An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination. Elife. 11, e76077 (2022).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).
- Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila. Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).
- Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region. J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).
