Op CRISPR gebaseerde strategie in één stap voor endogene gentagging in Drosophila melanogaster
Summary
Hier presenteren we een vereenvoudigd endogene gentagging-protocol voor Drosophila, dat gebruik maakt van een op PCR gebaseerde techniek voor markervrije identificatie van succesvolle genetische modificaties, waardoor de ontwikkeling van stabiele knock-in-lijnen wordt vergemakkelijkt.
Abstract
De studie van subcellulaire lokalisatie, dynamiek en regulatie van eiwitten in levende cellen is ingrijpend getransformeerd door de komst van technieken die het mogelijk maken om endogene genen te labelen om fluorescerende fusie-eiwitten te produceren. Deze methoden stellen onderzoekers in staat om eiwitgedrag in realtime te visualiseren, wat waardevolle inzichten oplevert in hun functies en interacties binnen de cellulaire omgeving. Veel huidige onderzoeken naar het taggen van genen maken gebruik van een proces in twee stappen waarbij zichtbare markers, zoals veranderingen in de oogkleur, worden gebruikt om genetisch gemodificeerde organismen in de eerste stap te identificeren en de zichtbare marker in de tweede stap wordt weggesneden. Hier presenteren we een eenstapsprotocol om nauwkeurige en snelle endogene gentagging uit te voeren in Drosophila melanogaster, waardoor screening op gemanipuleerde lijnen mogelijk is zonder de zichtbare oogmarker, wat een aanzienlijk voordeel biedt ten opzichte van eerdere methoden. Om te screenen op succesvolle gen-tagging-gebeurtenissen, gebruiken we een op PCR gebaseerde techniek om individuele vliegen te genotyperen door een klein segment van hun middenpoot te analyseren. Vliegen die aan de screeningscriteria voldoen, worden vervolgens gebruikt om stabiele bestanden te produceren. Hier beschrijven we het ontwerp en de constructie van CRISPR-bewerkingsplasmiden en methoden voor het screenen en bevestigen van gemanipuleerde lijnen. Samen verbetert dit protocol de efficiëntie van endogene gentagging in Drosophila aanzienlijk en maakt het studies van cellulaire processen in vivo mogelijk.
Introduction
Fluorescerende eiwitten zijn naar voren gekomen als krachtige hulpmiddelen voor het visualiseren van eiwitlokalisatie, dynamiek en eiwit-eiwitinteracties in cellen in levende organismen 1,2. Het taggen van endogene genen met fluorescerende eiwitten maakt langdurige live beeldvorming van cellulaire processen met subcellulaire resolutie mogelijk. Bovendien hebben deze endogene gen-labelingtechnieken verschillende voordelen ten opzichte van overexpressie- en immunokleuringsbenaderingen. Overexpressie van eiwitten kan bijvoorbeeld leiden tot verkeerde eiwitvouwing, niet-specifieke eiwit-eiwitinteracties en verkeerde lokalisatie3. Tot op heden zijn onderzoekers in staat geweest om enorme bibliotheken van endogene genen te creëren die zijn gefuseerd met fluorescerende eiwitten voor een paar modelorganismen, zoals ontluikende gist, die efficiënte homologe recombinatie kunnen ondergaan4. In het geval van Drosophila melanogaster zijn verschillende hulpmiddelen zoals MiMIC’s5, op transposon gebaseerde enhancervallen6 en fosmiden7 bedacht om genen fluorescerend te labelen.
De ontwikkeling van op CRISPR-Cas9 gebaseerde tools heeft het mogelijk gemaakt om genoombewerking, inclusief het taggen van endogene eiwitten, efficiënt uit te voeren in een breed scala aan modelorganismen 8,9. Cas9 is een RNA-geleid enzym dat dubbelstrengs DNA op een zeer efficiënte en specifieke manier splitst8, dat vervolgens kan worden gerepareerd door een niet-homologe eindverbinding (NHEJ) -route die leidt tot puntmutaties of -deleties. Als alternatief maakt de homologie-directed repair (HDR)-route de integratie van heteroloog DNA in het chromosoom mogelijk.
Eerdere methoden voor op CRISPR gebaseerde gentagging in het modelorganisme, Drosophila melanogaster, waren gebaseerd op een tweestapsproces 10,11,12. Dit omvat het gebruik van een waarneembare oogkleurmarkering, Dsred, om succesvolle HDR-gebeurtenissen te detecteren. Daarna zou de Dsred-marker worden weggesneden met behulp van het Cre/loxP-recombinatiesysteem. Om dit proces te stroomlijnen en te versnellen, presenteren we hier een eenvoudigere en efficiëntere methode. Deze aanpak omzeilt de noodzaak van dodelijke genotypering en maakt de directe screening van individuele vliegen mogelijk. In het bijzonder gebruiken we een op PCR gebaseerde benadering om DNA te extraheren uit een klein segment van de middelste poot van de vlieg, waardoor we individuele vliegen kunnen genotyperen. Deze procedure brengt met name de vitaliteit, beweging of voortplantingsmogelijkheden van de bemonsterde vlieg niet in gevaar. Alleen de geschikte individuen, die via deze methode worden geïdentificeerd, worden verder ontwikkeld tot stabiele bestanden.
Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het genereren van fluorescerende eiwitgelabelde vliegen waarin endogene genen worden gelabeld met fluorescerende reporters. Deze techniek maakt gebruik van CRISPR-Cas9-genoombewerking om elke gewenste fluorofoortag te fuseren met de N- of C-terminal van een endogeen gen. Hieronder beschrijven we het ontwerp en de constructie van gRNA-plasmiden en een donorplasmide, een eenstapsscreeningsstrategie om CRISPR-positieve vliegen te selecteren en stappen om stabiele lijnen vast te stellen. In het bijzonder beschrijven we strategieën om een endogene kernklok Drosophila-gen, punt uit, te labelen met een fluorofoor aan de C-terminal. We beschrijven ook kort de controle-experimenten die moeten worden uitgevoerd om te bevestigen dat het gelabelde eiwit functioneel is en live-imaging-technieken om het periode-eiwit te visualiseren in levende klokneuronen in intacte Drosophila-hersenen 13. Het hier beschreven protocol is ook breed toepasbaar om kandidaten te screenen op deleties en inserties van specifieke stukjes DNA door CRISPR-Cas9 genoombewerking.
Protocol
Representative Results
Discussion
De resultaten demonstreren een gestroomlijnde, eenvoudige CRISPR-gebaseerde strategie in één stap voor het taggen van endogene genen in Drosophila. In het protocol gebruiken we twee gRNA’s om DNA-dubbelstrengsbreuk en homologe recombinatie efficiënter te induceren. De gRNA’s en het donorplasmide worden geïnjecteerd in fruitvliegembryo’s, die het Cas9-enzym tot expressie brengen in hun kiembaan. Deze embryo’s worden vervolgens onder standaardomstandigheden gekweekt tot ze volwassen zijn, waarna ze worden gekr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken George Watase en Josie Clowney voor de discussies tijdens de beginfase van de ontwikkeling van het protocol. Het werk werd ondersteund door fondsen van de NIH (subsidie nr. R35GM133737 aan S.Y.), Alfred P. Sloan Fellowship (aan S.Y.) en McKnight Scholar Award (aan S.Y.).
Materials
| 0.5M EDTA pH8.0 | Invitrogen | AM9260G | |
| 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987H | |
| 96-well deep well plate | BRAND | 701354 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-500 | |
| BbsI-HF | NEB | R3539S | |
| DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
| D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| EcoRI-HF | NEB | R3101S | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A142-212 | |
| Prolong Glass Antifade Mounting Medium | Invitrogen | P36982 | |
| Proteinase K | QIAGEN | 19131 | |
| Schneider's Drosophila Medium | Gibco | 21720001 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202S | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| XbaI | NEB | R0145S |
References
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol Rev. 90 (3), 1103-1163 (2010).
- Costantini, L. M., et al. A palette of fluorescent proteins optimized for diverse cellular environments. Nat Commun. 6, 7670 (2015).
- Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nat Methods. 10 (8), 715-721 (2013).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Venken, K. J., et al. MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes. Nat Methods. 8 (9), 737-743 (2011).
- Quinones-Coello, A. T., et al. Exploring strategies for protein trapping in Drosophila. 遗传学. 175 (3), 1089-1104 (2007).
- Sarov, M., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. Elife. 5, e12068 (2016).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8, 2281-2308 (2013).
- Port, F., Chen, H. M., Lee, T., Bullock, S. L. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (29), E2967-E2976 (2014).
- Gratz, S. J., et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. 遗传学. 196 (4), 961-971 (2014).
- Kanca, O., et al. An efficient CRISPR-based strategy to insert small and large fragments of DNA using short homology arms. Elife. 8, e51539 (2019).
- Lamb, A. M., Walker, E. A., Wittkopp, P. J. Tools and strategies for scarless allele replacement in Drosophila using CRISPR/Cas9. Fly (Austin). 11 (1), 53-64 (2017).
- Xiao, Y., Yuan, Y., Jimenez, M., Soni, N., Yadlapalli, S. Clock proteins regulate spatiotemporal organization of clock genes to control circadian rhythms. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (28), e2019756118 (2021).
- Costantini, L. M., Fossati, M., Francolini, M., Snapp, E. L. Assessing the tendency of fluorescent proteins to oligomerize under physiologic conditions. Traffic. 13 (5), 643-649 (2012).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist’s user guide. Trends Cell Biol. 19 (11), 649-655 (2009).
- Kanca, O., et al. An expanded toolkit for Drosophila gene tagging using synthesized homology donor constructs for CRISPR-mediated homologous recombination. Elife. 11, e76077 (2022).
- Nitabach, M. N., Taghert, P. H. Organization of the Drosophila circadian control circuit. Curr Biol. 18 (2), R84-R93 (2008).
- Carvalho, G. B., Ja, W. W., Benzer, S. Non-lethal PCR genotyping of single Drosophila. Biotechniques. 46 (4), 312-314 (2009).
- Gummadova, J. O., Coutts, G. A., Glossop, N. R. J. Analysis of the Drosophila Clock promoter reveals heterogeneity in expression between subgroups of central oscillator cells and identifies a novel enhancer region. J Biol Rhythms. 24 (5), 353-367 (2009).
