拟 南芥 花粉管接收和半体外隔膜法 双受精的实时成像
Summary
在这里，我们描述了用于观察拟南芥花粉管引导和接收的半体外（SIV）方法的改进，该方法增加了胚珠的接受性。高通量SIV暨隔膜法可以与配子体标记系和遗传编码生物传感器相结合，以监测受精的动态过程。
Abstract
在开花植物中，雌蕊内花粉管（雄配子体）的生长和引导以及雌配子体对花粉管的接收对于双重受精和随后的种子发育至关重要。在花粉管接收过程中，雄性和雌配子体之间的相互作用最终导致花粉管破裂和两个精子细胞的释放以实现双重受精。由于花粉管生长和双重受精深深地隐藏在花的组织中，这个过程在 体内很难观察到。
在几项研究中，已经开发并实施了用于模式植物拟南芥受精活细胞成像的半体外（SIV）方法。这些研究有助于阐明开花植物受精过程的基本特征，以及在雄性和雌配子体相互作用期间发生哪些细胞和分子变化。然而，由于这些活细胞成像实验涉及单个胚珠的切除，因此每次成像会话的观察次数很少，这使得这种方法既乏味又非常耗时。除其他技术困难外，经常报告花粉管未能在体外使胚珠受精，这严重混淆了这种分析。
在这里，提供了一个详细的视频协议，用于以自动化和高通量的方式对花粉管接收和受精进行成像，允许每次成像会话最多观察40次花粉管接收和破裂。结合使用基因编码的生物传感器和标记线，该方法能够以更少的时间投资生成大样本量。该技术的细微差别和关键点，包括花分期、解剖、培养基制备和成像，都以视频格式清晰详细，以促进未来对花粉管引导、接收和双重受精动力学的研究。
Introduction
有性繁殖生物中遗传上独特的后代的产生取决于雄性和雌性配子的成功融合。在开花植物中，两个雄配子（精子细胞）与两个雌配子（卵细胞和中央细胞）在双重受精过程中的相互作用取决于花粉管（雄配子体）释放的精子。这个过程称为花粉管接收，主要由驻留在胚胎囊（雌配子体）内的协同细胞控制1，2。由于花粉管接收发生在花的深处，因此已经建立了一种允许对该过程进行活细胞成像的方法，称为半体外（SIV）花粉管接收3。使用这种方法，将切除的拟南芥胚珠放置在半液体花粉萌发培养基上，并通过花粉管靶向，花粉管通过样式传递道连接处切断的雌蕊的柱头和样式生长3，4。自从这项技术发展以来，详细的观察导致了围绕花粉管引导、接收和受精的几个发现。其中，这些发现包括通过柱头生长获得花粉管靶向能力3，花粉管到达时协同细胞内钙振荡的开始5，6，7，8，9，以及花粉管破裂时精子细胞释放和受精的动力学10.然而，由于这种技术依赖于胚珠的切除，受精的观察数量有限，花粉管接收往往异常，导致花粉管破裂失败（视频1和补充文件1）。因此，需要一种更有效的方法，以便对花粉管接收和受精进行高通量分析。
在制定该协议时，测试了几种分析花粉管接收的新方法，从最“体外”到最“体内”的方法，并确定了基于整个隔膜切除的有效技术，该技术允许每天多达40次受精观察。在这里，概述了该技术的细微差别和关键点，包括花分期、解剖、培养基制备和成像设置。通过遵循该协议，应促进以花粉管引导，花粉管接收和双重受精为重点的研究。该方法允许的样本量越大，预计将增强从实时成像实验中得出的结论的科学合理性。该技术的潜在应用包括但不限于通过使用遗传编码的生物传感器观察配子体相互作用期间胞质钙浓度（[Ca2+]cyt），pH或H 2 O2的分子和生理变化。此外，使用这种改进的方法可以更容易地观察到细胞学变化，例如感受协同作用的退化，精子细胞迁移或核瑜伽。最后，可以在宽场显微镜下监测不同施肥阶段的时间，然后可以使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）或双光子激发显微镜（2PEM）进行更详细的分析，以获得更高的分辨率和3D重建。
Protocol
Representative Results
Discussion
这份手稿介绍了拟 南芥花粉管接收和双重受精成像的有效方案。改进的方法SIV 暨隔膜大大提高了每个成像会话可观察到的成功花粉管接收事件的百分比和总数。此处显示的代表性结果展示了一个成像会话，其中有41个成功的花粉管接收事件和10个显示接收缺陷的胚珠（~80%效率）。这是使用原始 SIV 切除胚珠方法在总共 8 次成像会话中捕获的成功花粉管接收事件数量的两倍多（?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Sara Simonini和Stefano Bencivenga捐赠 pFG：roGFP2-ORP1-NLS 构建体，感谢Christof Eichenberger，Johann Almendinger，Vincent Sutter和Celia Baroux对显微镜的建议。我们衷心感谢拉维·帕拉尼维卢、菲利普·丹宁格、莎朗·凯斯勒、马克·约翰逊、川岛智和以及 2022 年有性植物繁殖国际会议上对 SIV 暨隔 膜协议表现出兴趣的其他人的建议。这项工作得到了苏黎世大学的支持和瑞士国家科学基金会对U.G的资助。
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
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