Imágenes en vivo de la recepción del tubo polínico de Arabidopsis y la doble fertilización utilizando el método semi-in vitro cum septum
Summary
Aquí, describimos una mejora del método semi-in vitro (SIV) para observar la guía y recepción del tubo polínico en Arabidopsis thaliana, lo que aumenta la receptividad de los óvulos. El método SIV cum septum de alto rendimiento puede combinarse con líneas marcadoras de gametofitos y biosensores codificados genéticamente para monitorear el proceso dinámico de fertilización.
Abstract
En las plantas con flores, el crecimiento y la guía del tubo polínico (gametofito masculino) dentro del pistilo y la recepción del tubo polínico por el gametofito hembra son esenciales para la doble fertilización y el posterior desarrollo de la semilla. Las interacciones entre los gametofitos masculinos y femeninos durante la recepción del tubo polínico culminan en la ruptura del tubo polínico y la liberación de dos espermatozoides para efectuar una doble fertilización. Como el crecimiento del tubo polínico y la doble fertilización están profundamente ocultos dentro de los tejidos de la flor, este proceso es difícil de observar in vivo.
En varias investigaciones se ha desarrollado e implementado un método semi-in vitro (SIV) para la obtención de imágenes de células vivas de fertilización en la planta modelo Arabidopsis thaliana . Estos estudios han ayudado a dilucidar las características fundamentales de cómo se produce el proceso de fertilización en las plantas con flores y qué cambios celulares y moleculares se producen durante la interacción de los gametofitos masculinos y femeninos. Sin embargo, debido a que estos experimentos de imágenes de células vivas implican la escisión de óvulos individuales, están limitados a un bajo número de observaciones por sesión de imágenes, lo que hace que este enfoque sea tedioso y lleve mucho tiempo. Entre otras dificultades técnicas, a menudo se informa de un fallo de los tubos polínicos para fertilizar los óvulos in vitro , lo que confunde gravemente tales análisis.
Aquí, se proporciona un protocolo de video detallado para la obtención de imágenes de la recepción y fertilización del tubo polínico de manera automatizada y de alto rendimiento, lo que permite hasta 40 observaciones de la recepción y ruptura del tubo polínico por sesión de imágenes. Junto con el uso de biosensores codificados genéticamente y líneas marcadoras, este método permite la generación de grandes tamaños de muestra con una inversión de tiempo reducida. Los matices y puntos críticos de la técnica, incluida la estadificación floral, la disección, la preparación del medio y las imágenes, se detallan claramente en formato de video para facilitar futuras investigaciones sobre la dinámica de la guía, recepción y doble fertilización del tubo polínico.
Introduction
La generación de descendencia genéticamente única en organismos que se reproducen sexualmente depende de la fusión exitosa de gametos masculinos y femeninos. En las plantas con flores, la interacción de dos gametos masculinos (espermatozoides) con dos gametos femeninos (óvulo y célula central) durante la doble fertilización depende de la liberación de espermatozoides del tubo polínico (el gametofito masculino). Este proceso, llamado recepción del tubo polínico, está controlado en gran medida por las células sinérgicas que residen dentro del saco embrionario (el gametofito femenino)1,2. Como la recepción del tubo polínico tiene lugar en el interior de la flor, se ha establecido un método que permite obtener imágenes de células vivas del proceso, llamado recepción del tubo polínico semi-in vitro (SIV)3. Con este método, los óvulos de Arabidopsis extirpados se colocan en un medio de germinación de polen semilíquido y se dirigen a tubos de polen que crecen a través del estigma y el estilo de un pistilo cortado en la unión del tracto transmisor del estilo 3,4. Desde el desarrollo de esta técnica, las observaciones detalladas han llevado a varios descubrimientos en torno a la guía, recepción y fertilización del tubo polínico. Entre otros, estos descubrimientos incluyen la adquisición de la competencia dirigida al tubo polínico por crecimiento a través del estigma3, el inicio de oscilaciones intracelulares de calcio en las sinérgicas a la llegada del tubo polínico 5,6,7,8,9, y la dinámica de la liberación y fertilización de los espermatozoides tras la explosión del tubo polínico10 . Sin embargo, debido a que esta técnica se basa en la escisión de óvulos, las observaciones de fertilización son limitadas en número, y la recepción del tubo polínico es a menudo aberrante, lo que resulta en el fracaso de la ruptura del tubo polínico (Video 1 y Archivo Suplementario 1). Por lo tanto, existe la necesidad de un enfoque más eficiente que permita análisis de alto rendimiento de la recepción del tubo polínico y la fertilización.
Al desarrollar este protocolo, se probaron varios enfoques nuevos para analizar la recepción del tubo polínico, que abarcan desde los métodos más “in vitro” hasta los más “in vivo“, y se estableció una técnica eficiente basada en la escisión de todo el tabique, que permite hasta 40 observaciones de fertilización por día. Aquí, se describen los matices y los puntos críticos de la técnica, incluida la puesta en escena de flores, la disección, la preparación del medio y la configuración de imágenes. Al seguir este protocolo, se debe facilitar la investigación centrada en la guía del tubo polínico, la recepción del tubo polínico y la doble fertilización. Se espera que los tamaños de muestra más altos que permite el método refuercen la solidez científica de las conclusiones extraídas de los experimentos de imágenes en vivo. Las aplicaciones potenciales de esta técnica incluyen, pero no se limitan a, realizar observaciones de los cambios moleculares y fisiológicos en las concentraciones citosólicas de calcio ([Ca2+]cyt), pH oH2O2 durante las interacciones de gametofitos mediante el uso de biosensores codificados genéticamente. Además, los cambios citológicos, como la degeneración de la sinergia receptiva, la migración de espermatozoides o la cariogamia, se pueden observar más fácilmente utilizando este método mejorado. Finalmente, el momento de las diferentes etapas de la fertilización se puede monitorear bajo microscopía de campo amplio, y luego se pueden realizar análisis más detallados utilizando microscopía de barrido láser confocal (CLSM) o microscopía de excitación de dos fotones (2PEM) para una mayor resolución y reconstrucción 3D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este manuscrito introduce un protocolo eficiente para la obtención de imágenes de la recepción del tubo polínico y la doble fertilización en Arabidopsis. El método mejorado, SIV cum septum, aumenta en gran medida el porcentaje y el número total de eventos exitosos de recepción del tubo polínico que son observables por sesión de imagen. Los resultados representativos que se muestran aquí demuestran una sesión de imagen con 41 eventos exitosos de recepción del tubo polínico y 10 óvulos que …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Sara Simonini y Stefano Bencivenga por donar la construcción pFG:roGFP2-ORP1-NLS y a Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter y Celia Baroux por sus consejos sobre microscopía. Agradecemos amablemente el consejo de Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima y todos los demás en la Conferencia Internacional sobre Reproducción Sexual de Plantas 2022 que mostraron interés en un protocolo sobre SIV cum septum. Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Zurich y subvenciones de la Fundación Nacional Suiza de Ciencias a la U.G.
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
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