Arabidopsis 꽃가루관 수용 및 이중 수정의 실시간 이미징 semi-In vitro cum septum 방법을 사용한
Summary
여기에서 우리는 난자의 수용성을 증가시키는 Arabidopsis thaliana에서 꽃가루 튜브 안내 및 수신을 관찰하기 위한 SIV(semi-in vitro) 방법의 개선을 설명합니다. 고처리량 SIV 겸 중격 방법은 배우자 마커 라인 및 유전적으로 인코딩된 바이오센서와 결합하여 수정의 동적 과정을 모니터링할 수 있습니다.
Abstract
꽃 피는 식물에서 암술 내 꽃가루관(수컷 배우체)의 성장과 안내, 암컷 배우체에 의한 꽃가루관의 수용은 이중 수정과 후속 종자 발달에 필수적입니다. 꽃가루 관을 수용하는 동안 수컷과 암컷 배우체 사이의 상호 작용은 꽃가루 관 파열과 두 개의 정자 세포의 방출로 절정에 달하여 이중 수정을 일으킵니다. 꽃가루 관의 성장과 이중 수정은 꽃의 조직 내에 깊숙이 숨겨져 있기 때문에 이 과정은 생체 내에서 관찰하기 어렵습니다.
모델 식물 Arabidopsis thaliana에서 수정의 생세포 이미징을 위한 반시험관(SIV) 방법이 여러 조사에서 개발 및 구현되었습니다. 이러한 연구는 꽃 피는 식물에서 수정 과정이 어떻게 발생하는지, 그리고 수컷과 암컷 배우체의 상호 작용 중에 어떤 세포 및 분자 변화가 발생하는지에 대한 근본적인 특징을 밝히는 데 도움이 되었습니다. 그러나 이러한 생세포 이미징 실험에는 개별 난자의 절제가 포함되기 때문에 이미징 세션당 관찰 횟수가 적기 때문에 이 접근 방식은 지루하고 시간이 많이 걸립니다. 다른 기술적 어려움 중에서도 꽃가루 관이 시험관 내에서 난자를 수정하지 못하는 경우가 종종 보고되어 이러한 분석이 심각하게 혼란스러워집니다.
여기에서는 자동화되고 높은 처리량 방식으로 꽃가루 튜브 수용 및 수정을 이미징하기 위한 자세한 비디오 프로토콜이 제공되어 이미징 세션당 꽃가루 튜브 수신 및 파열을 최대 40개까지 관찰할 수 있습니다. 유전적으로 암호화된 바이오센서 및 마커 라인의 사용과 함께 이 방법을 사용하면 시간 투자를 줄이면서 큰 크기의 샘플을 생성할 수 있습니다. 꽃 스테이징, 해부, 배지 준비 및 이미징을 포함한 기술의 뉘앙스와 중요한 점은 꽃가루 튜브 안내, 수용 및 이중 수정의 역학에 대한 향후 연구를 용이하게 하기 위해 비디오 형식으로 명확하게 자세히 설명되어 있습니다.
Introduction
유성 생식 유기체에서 유전적으로 독특한 자손의 생성은 남성과 여성 배우자의 성공적인 융합에 달려 있습니다. 꽃 피는 식물에서 이중 수정 동안 두 개의 수컷 배우자(정자 세포)와 두 개의 암컷 배우자(난자 세포 및 중앙 세포)의 상호 작용은 꽃가루관(수컷 배우체)에서 정자 방출에 달려 있습니다. 꽃가루 관 수용이라고 하는 이 과정은 배낭(암컷 배우체) 내에 존재하는 시너지 세포에 의해 크게 제어됩니다.1,2. 꽃가루관 수용이 꽃 속 깊숙한 곳에서 일어나기 때문에, 이 과정의 생세포 이미징을 가능하게 하는 방법인 SIV(semi-in vitro (semi-in vitro) 꽃가루관 수용)가 확립되었다3. 이 방법을 사용하면 절제된 애기장대 난자를 반액체 꽃가루 발아 배지에 놓고 스타일 전달관접합부 3,4에서 절단된 암술의 암술머리와 스타일을 통해 자라는 꽃가루 관을 표적으로 합니다. 이 기술의 개발 이후, 상세한 관찰은 꽃가루 튜브 안내, 수용 및 수정을 둘러싼 몇 가지 발견으로 이어졌습니다. 그 중에서도 이러한 발견에는 암술머리3를 통한 성장에 의한 꽃가루관 표적화 능력의 획득, 꽃가루관 도착 시 시너지드에서 세포내 칼슘 진동의시작5,6,7,8,9, 꽃가루관 파열 시 정자 세포 방출 및 수정의 역학 등이 포함된다10 . 그럼에도 불구하고 이 기술은 난자 절제에 의존하기 때문에 수정 관찰 횟수가 제한되고 꽃가루 관 수용이 종종 비정상적이어서 꽃가루 관 파열이 실패합니다(비디오 1 및 보충 파일 1). 따라서 꽃가루 관 수용 및 수정에 대한 고처리량 분석을 가능하게 하는 보다 효율적인 접근 방식이 필요합니다.
이 프로토콜을 개발하면서 가장 “시험관 내“에서 가장 “생체 내” 방법에 이르기까지 꽃가루 관 수용을 분석하기 위한 몇 가지 새로운 접근 방식을 테스트했으며 전체 중격의 절제를 기반으로 하는 효율적인 기술이 정착되어 하루에 최대 40회의 수정 관찰이 가능합니다. 여기에서는 꽃 스테이징, 해부, 중간 준비 및 이미징 설정을 포함하여 기술의 뉘앙스와 중요한 점을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜에 따라 꽃가루관 안내, 꽃가루관 수용 및 이중 수정에 중점을 둔 연구가 촉진되어야 합니다. 이 방법이 허용하는 더 높은 샘플 크기는 라이브 이미징 실험에서 도출된 결론의 과학적 건전성을 강화할 것으로 예상됩니다. 이 기술의 잠재적 응용 분야에는 유전적으로 암호화된 바이오센서를 사용하여 배우체 상호작용 동안 세포질 칼슘 농도([Ca 2+]cyt), pH 또는 H2O 2의 분자 및 생리학적 변화를 관찰하는 것이포함되지만 이에 국한되지는 않습니다. 또한, 수용 시너지 효과의 퇴화, 정자 세포 이동 또는 카르요가미와 같은 세포학적 변화는 이 개선된 방법을 사용하여 보다 쉽게 관찰할 수 있습니다. 마지막으로, 광시야 현미경으로 다양한 수정 단계의 시기를 모니터링한 다음 공초점 레이저 주사 현미경(CLSM) 또는 이광자 여기 현미경(2PEM)을 사용하여 보다 자세한 분석을 수행하여 고해상도 및 3D 재구성을 수행할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 원고는 애기장대에서 꽃가루 관 수용 및 이중 수정의 이미징을 위한 효율적인 프로토콜을 소개합니다. 개선된 방법인 SIV cum septum은 이미징 세션당 관찰할 수 있는 성공적인 꽃가루관 수용 이벤트의 백분율과 총 수를 크게 증가시킵니다. 여기에 표시된 대표적인 결과는 41개의 성공적인 꽃가루 튜브 수신 이벤트와 수신 결함(~80% 효율)을 나타내는 10개의 난자가 있는 이미징 세션을 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
pFG:roGFP2-ORP1-NLS 구조를 기증해 주신 Sara Simonini와 Stefano Bencivenga, 현미경에 대한 조언을 해주신 Christof Eichenberger, Johann Almendinger, Vincent Sutter 및 Celia Baroux에게 감사드립니다. Ravi Palanivelu, Philipp Denninger, Sharon Kessler, Mark Johnson, Tomokazu Kawashima 및 SIV 겸 중격에 대한 프로토콜에 관심을 보인 2022년 성 식물 생식에 관한 국제 회의의 다른 모든 사람들의 조언을 진심으로 감사드립니다. 이 연구는 취리히 대학 (University of Zurich)과 스위스 국립 과학 재단 (Swiss National Science Foundation)의 보조금을 지원했습니다.
Materials
| 1 mm glass slide | Epredia | 16211551 | |
| 35 mm glass bottom dish (14 mm well) | Mattek | P35G-1.5-14-C | |
| Calcium Chloride | Roth | CN93.1 | |
| Columbia (Col-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | stigma donor | |
| Dissecting Scope | Olympus | SZX2-ILLT | |
| Insulin needle (0.3 G) | BD | 304000 | |
| Landsberg erecta (Ler-0) | Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) | septum donor | |
| Magnesium Sulfate | Merck | 5886 | |
| Potassium Chloride | Roth | 6781.1 | |
| Razor blade | Beldura | 7026797 | |
| Scotch double sided tape | Scotch | 768720 | Less thick and good for stigma dissection |
| Sodium Chloride | Roth | 3957.1 | |
| Sucrose | ITW reagents | A2211,1000 | |
| Tesa double sided tape | Tesa | 05681-00018 | Very sticky and good for septum dissection |
| Ultra low gelling temperature agarose | FMC SeaPrep | 50302 |
References
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