Basis driedimensionaal (3D) darmmodelsysteem met een immuuncomponent

Summary

Hier beschrijven we de constructie van een basis driedimensionaal (3D) intestinale cellijnmodelsysteem en een paraffine-inbeddingsprotocol voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten. Kleuring van geselecteerde eiwitten maakt de analyse van meerdere visuele parameters van een enkel experiment mogelijk voor mogelijk gebruik in preklinische onderzoeken naar geneesmiddelen.

Abstract

Er is een toename in het gebruik van in vivo en in vitro darmmodellen voor het bestuderen van de pathofysiologie van inflammatoire darmziekten, voor de farmacologische screening van potentieel heilzame stoffen en voor toxiciteitsstudies op potentieel schadelijke voedingsbestanddelen. Relevant is dat er momenteel vraag is naar de ontwikkeling van celgebaseerde in-vitromodellen ter vervanging van diermodellen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een basis, “gezond weefsel” driedimensionaal (3D) intestinaal equivalente model met behulp van cellijnen met het dubbele voordeel van zowel experimentele eenvoud (gestandaardiseerd en gemakkelijk herhaalbaar systeem) als fysiologische complexiteit (Caco-2-enterocyten met een ondersteunende immuuncomponent van U937-monocyten en L929-fibroblasten). Het protocol omvat ook paraffine-inbedding voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten, waardoor het voordeel wordt geboden van het analyseren van meerdere visuele parameters uit een enkel experiment. Hematoxyline- en eosine-gekleurde (H&E) gekleurde secties die laten zien dat de Caco-2-kolomvormige cellen een strakke en regelmatige monolaag vormen in controlebehandelingen, worden gebruikt om de werkzaamheid van het model als experimenteel systeem te verifiëren. Door gluten als pro-inflammatoire voedselcomponent te gebruiken, omvatten de geanalyseerde parameters van secties een verminderde monolaagdikte, evenals verstoring en loslating van de onderliggende matrix (H&E), verminderde tight junction-eiwitexpressie zoals blijkt uit occludinekleuring (statistisch kwantificeerbaar) en immuunactivering van migrerende U937-cellen, zoals blijkt uit de cluster van differentiatie 14 (CD14)-kleuring en CD11b-gerelateerde differentiatie in macrofagen. Zoals aangetoond door lipopolysaccharide te gebruiken om darmontsteking te simuleren, zijn aanvullende parameters die kunnen worden gemeten verhoogde slijmkleuring en cytokine-expressie (zoals midkine) die voorafgaand aan fixatie uit het medium kunnen worden geëxtraheerd. Het driedimensionale (3D) basismodel van het darmslijmvlies en de vaste secties kunnen worden aanbevolen voor onderzoeken naar de ontstekingsstatus en de integriteit van de barrière, met de mogelijkheid om meerdere visueel kwantificeerbare parameters te analyseren.

Introduction

De intestinale epitheelbarrière, een eencellige dikke binnenbekleding die verschillende soorten epitheelcellen bevat, vormt de eerste fysieke verdedigingsbarrière of interface tussen de buitenkant en het interne milieu van het lichaam ^1,2. Enterocyten van het zuilvormige type vormen het meest voorkomende type epitheelcellen. Deze zijn verantwoordelijk voor het handhaven van de integriteit van de epitheliale barrière door interacties tussen verschillende barrièrecomponenten, waaronder tight junctions (TJ’s), die een belangrijke rol spelen bij het aanhalen van de barrière ^1,3. De TJ-structuur bestaat uit intracellulaire plaque-eiwitten, zoals zonula occludens (ZO) en cinguline, die samenwerken met transmembraaneiwitten, waaronder occludines, claudines en junctionele adhesiemoleculen (JAM’s) die een ritsachtige structuur vormen die de naburige cellen nauw met elkaar verbindt^. De transmembraaneiwitten reguleren de passieve paracellulaire diffusie van kleine verbindingen en sluiten toxische grote moleculen uit.

Potentieel giftige voedselverbindingen en voedselcontaminanten stimuleren de productie van inflammatoire cytokines die de epitheliale permeabiliteit verstoort, immuuncellen activeert en chronische darmweefselontsteking veroorzaakt ^5,6,7. Daarentegen is gemeld dat verschillende antioxiderende en ontstekingsremmende fytochemicaliën de expressie van inflammatoire cytokines verminderen en de integriteit van de intestinale TJ-barrière verbeteren door het herstel van de expressie en assemblage van TJ-eiwitten ^4,6,8. Vandaar dat de regulering van de integriteit van de epitheliale barrière door zowel nuttige als schadelijke verbindingen heeft geleid tot een toename van het gebruik van zowel in vivo als in vitro modellen die gericht zijn op het nabootsen van de darmbarrière voor farmaceutische screening en toxiciteitsstudies. Dit is met name relevant gezien de toenemende belangstelling voor het begrijpen van de pathofysiologie van intestinale darmziekten (IBD), necrotiserende enterocolitis en kanker, die kunnen worden gesimuleerd in experimentele modellen ^8,9,10.

Er is vraag naar de ontwikkeling van op cellen gebaseerde in-vitromodellen om de doelstelling van de “3V’s” in dierproeven te bereiken. Deze omvatten vervangende alternatieven voor het gebruik van dieren, vermindering van het aantal gebruikte dieren en verfijning in het toepassen van methoden die het leed verlichten 11,12,13. Bovendien zijn de onderliggende moleculaire, cellulaire en fysiologische mechanismen tussen menselijke en muizenmodellen (knaagdieren zijn de meest gebruikte soorten) onderscheidend, wat leidt tot controverse over de werkzaamheid van de muizenmodellen als voorspellers van menselijke reacties^12,13. Talrijke voordelen van in vitro menselijke cellijnmodellen zijn onder meer doelbeperkte experimenten, directe observatie en continue analyse¹³.

Monolagen van het eencellige type in tweedimensionale (2D) culturen hebben als krachtige modellen gediend. Deze kunnen echter niet precies de fysiologische complexiteit van menselijke weefsels reproduceren ^8,13,14. Als gevolg hiervan worden 3D-kweeksystemen ontwikkeld met steeds grotere verbeteringen om de fysiologische complexiteit van zowel gezonde als zieke darmweefsels samen te vatten als toolboxen voor risicobeoordeling van de volgende generatie^13,14. Deze modellen omvatten 3D Transwell-steigers met diverse cellijnen, organoïdeculturen en microfluïdische apparaten (darm-op-chip) met behulp van zowel cellijnen als organoïden (afkomstig van zowel gezonde als zieke weefsels)^8,13,14.

Het 3D-protocol voor het equivalent van de darm “gezond weefsel” dat in de huidige studie werd gepresenteerd, was gebaseerd op het vinden van een evenwicht tussen fysiologische complexiteit en experimentele eenvoud¹³. Het model is representatief voor een 3D Transwell-steiger, bestaande uit drie cellijnen (enterocyten [de gouden standaard colonadenocarcinoom Caco-2-lijn] met een ondersteunende immuuncomponent [U937-monocyten en L929-fibroblasten]), die een gestandaardiseerd en gemakkelijk herhaalbaar systeem vormen dat van toepassing is op de voorlopige screening van voedingsmoleculen die van belang zijn voor de integriteit van de darmepitheliale barrière en de immuunrespons. Het protocol omvat paraffine-inbedding voor lichtmicroscopische evaluatie van de integriteit van de epitheliale barrière met behulp van vaste intestinale equivalenten. Het voordeel van de huidige aanpak is dat meerdere delen van de ingebedde weefsels kunnen worden gekleurd voor meerdere parameters uit een enkel experiment.

Protocol

1. Voorbereiding van het 3D-gereconstrueerde darmslijmvliesmodel OPMERKING: De hele procedure moet worden uitgevoerd in een steriele laminaire stroomkap. Alle stappen in de procedure waarbij de celincubator wordt gebruikt, betekenen dat culturen worden geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer die 5% CO2 bevat (tenzij anders vermeld in het protocol). Voorafgaande voorbereiding van de cellijnen die worden gebruikt in het darmmodelsysteemZaad L9…

Representative Results

Het eerste belangrijke aspect is het bepalen van de aanvaardbaarheid van het basale 3D-darmequivalente slijmvlies voor experimentele doeleinden. Dit wordt uitgevoerd met de meest gebruikte kleuring in histologie- en histopathologielaboratoria, namelijk hematoxyline (kleurt nucleair materiaal diepblauw-paarse kleur) en eosine (kleurt cytoplasmatisch materiaal in verschillende tinten roze). De H&E-kleuring wordt eerst uitgevoerd op een onbehandelde controlegroep, die wordt gekweekt onder dezelfde omstandigheden en hetzelfd…

Discussion

Het hier gepresenteerde gereconstrueerde modelsysteem voor het gereconstrueerde darmslijmvlies (figuur 6) combineert fysiologische complexiteit (meer fysiologisch relevante 3D-celculturen met een Caco-2-monolaag met een ECM-rijke lamina propria-ondersteuning die fibroblasten en monocyten bevat) met experimentele eenvoud (het gebruik van commerciële menselijke cellijnen om een gestandaardiseerd en gemakkelijk herhaalbaar systeem te produceren)¹³. Als zodanig wordt dit…