Système de modèle intestinal tridimensionnel (3D) de base avec une composante immunitaire

Summary

Nous décrivons ici la construction d’un système modèle de base de lignées cellulaires intestinales tridimensionnelles (3D) et d’un protocole d’enrobage de paraffine pour l’évaluation par microscopie optique d’équivalents intestinaux fixes. La coloration de protéines sélectionnées permet d’analyser plusieurs paramètres visuels à partir d’une seule expérience en vue d’une utilisation potentielle dans des études précliniques de criblage de médicaments.

Abstract

Il y a eu une augmentation de l’utilisation de modèles intestinaux in vivo et in vitro pour étudier la physiopathologie des maladies inflammatoires intestinales, pour le criblage pharmacologique de substances potentiellement bénéfiques et pour les études de toxicité sur des composants alimentaires potentiellement nocifs. Il est important de noter qu’il existe actuellement une demande pour le développement de modèles in vitro à base de cellules pour remplacer les modèles animaux. Ici, un protocole pour un modèle de base d’équivalent intestinal tridimensionnel (3D) de « tissu sain » utilisant des lignées cellulaires est présenté avec le double avantage d’offrir à la fois une simplicité expérimentale (système standardisé et facilement reproductible) et une complexité physiologique (entérocytes Caco-2 avec une composante immunitaire de soutien des monocytes U937 et des fibroblastes L929). Le protocole comprend également l’enrobage de paraffine pour l’évaluation par microscopie optique d’équivalents intestinaux fixes, offrant ainsi l’avantage d’analyser plusieurs paramètres visuels à partir d’une seule expérience. Des coupes colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) montrant les cellules cylindriques Caco-2 formant une monocouche serrée et régulière dans les traitements témoins sont utilisées pour vérifier l’efficacité du modèle en tant que système expérimental. En utilisant le gluten comme composant alimentaire pro-inflammatoire, les paramètres analysés à partir des coupes comprennent une épaisseur de monocouche réduite, ainsi qu’une perturbation et un détachement de la matrice sous-jacente (H & E), une diminution de l’expression de la protéine de jonction serrée comme le montre la coloration à l’occludine (quantifiable statistiquement) et l’activation immunitaire des cellules U937 migrantes, comme en témoigne la coloration en grappe de différenciation 14 (CD14) et la différenciation liée à CD11b en macrophages. Comme le montre l’utilisation de lipopolysaccharides pour simuler l’inflammation intestinale, des paramètres supplémentaires qui peuvent être mesurés sont l’augmentation de la coloration du mucus et l’expression des cytokines (telles que la midkine) qui peuvent être extraites du milieu avant la fixation. Le modèle de base tridimensionnel (3D) de la muqueuse intestinale et les coupes fixes peuvent être recommandés pour les études de l’état inflammatoire et de l’intégrité de la barrière avec la possibilité d’analyser plusieurs paramètres visuels quantifiables.

Introduction

La barrière épithéliale intestinale, une paroi interne d’une cellule d’épaisseur contenant différents types de cellules épithéliales, constitue la première barrière défensive physique ou interface entre le milieu extérieur et le milieu interne du corps ^1,2. Les entérocytes de type cylindrique constituent le type de cellules épithéliales le plus abondant. Ceux-ci sont responsables du maintien de l’intégrité de la barrière épithéliale grâce à des interactions entre plusieurs composants de la barrière, y compris les jonctions serrées (TJ), jouant un rôle important dans le resserrement de la barrière ^1,3. La structure TJ est constituée de protéines de plaque intracellulaire, telles que les occlusions zonules (ZO) et la cinguline, qui coopèrent avec des protéines transmembranaires, notamment les occlusines, les claudines et les molécules d’adhésion jonctionnelle (JAM) qui forment une structure en forme de fermeture éclair reliant étroitement les cellules voisines ^3,4. Les protéines transmembranaires régulent la diffusion paracellulaire passive des petits composés et excluent les grosses molécules toxiques.

Les composés alimentaires potentiellement toxiques et les contaminants alimentaires stimulent la production de cytokines inflammatoires qui perturbent la perméabilité épithéliale, activant les cellules immunitaires et provoquant une inflammation chronique des tissus intestinaux ^5,6,7. En revanche, divers composés phytochimiques antioxydants et anti-inflammatoires ont été signalés pour réduire l’expression des cytokines inflammatoires et améliorer l’intégrité de la barrière intestinale TJ grâce à la restauration de l’expression et de l’assemblage de la protéine TJ ^4,6,8. Par conséquent, la régulation de l’intégrité de la barrière épithéliale par des composés bénéfiques et nocifs a vu une augmentation de l’utilisation de modèles in vivo et in vitro visant à imiter la barrière intestinale pour le dépistage pharmaceutique et les études de toxicité. Ceci est particulièrement pertinent compte tenu de l’intérêt croissant pour la compréhension de la physiopathologie des maladies intestinales de l’intestin (MICI), de l’entérocolite nécrosante et du cancer, qui peut être simulée dans les modèles expérimentaux ^8,9,10.

Il y a eu une demande pour le développement de modèles in vitro cellulaires afin d’atteindre l’objectif des « 3R » dans l’expérimentation animale. Il s’agit notamment de solutions de remplacement à l’utilisation d’animaux, de la réduction du nombre d’animaux utilisés et de l’amélioration de l’adoption de méthodes qui atténuent la détresse 11,12,13. De plus, les mécanismes moléculaires, cellulaires et physiologiques sous-jacents entre les modèles humains et murins (les rongeurs étant l’espèce la plus utilisée) sont distincts, ce qui conduit à une controverse concernant l’efficacité des modèles murins en tant que prédicteurs des réponses humaines^12,13. Parmi les nombreux avantages des modèles de lignées cellulaires humaines in vitro, citons l’expérimentation restreinte à la cible, l’observation directe et l’analyse continue¹³.

Les monocouches de type unicellulaire dans les cultures bidimensionnelles (2D) ont servi de modèles puissants. Cependant, ceux-ci ne peuvent pas reproduire avec précision la complexité physiologique des tissus humains ^8,13,14. En conséquence, des systèmes de culture 3D sont en cours de développement avec des améliorations toujours croissantes pour récapituler la complexité physiologique des tissus intestinaux sains et malades en tant que boîtes à outils d’évaluation des risques de nouvelle génération^13,14. Ces modèles comprennent des échafaudages Transwell 3D avec diverses lignées cellulaires, des cultures d’organoïdes et des dispositifs microfluidiques (intestin sur puce) utilisant à la fois des lignées cellulaires et des organoïdes (dérivés de tissus sains et malades)^8,13,14.

Le protocole équivalent intestinal 3D « tissu sain » présenté dans la présente étude était basé sur la recherche d’un équilibre entre la complexité physiologique et la simplicité expérimentale¹³. Le modèle est représentatif d’un échafaudage Transwell 3D, composé de trois lignées cellulaires (entérocytes [la lignée Caco-2 de référence de l’adénocarcinome du côlon] avec une composante immunitaire de soutien [monocytes U937 et fibroblastes L929]), constituant un système standardisé et facilement reproductible applicable au criblage préliminaire de molécules alimentaires d’intérêt sur l’intégrité de la barrière épithéliale intestinale et la réponse immunitaire. Le protocole comprend l’enrobage de paraffine pour l’évaluation microscopique de l’intégrité de la barrière épithéliale à l’aide d’équivalents intestinaux fixes. L’avantage de l’approche actuelle est qu’il est possible de colorer de nombreuses sections des tissus intégrés pour plusieurs paramètres à partir d’une seule expérience.

Protocol

1. Préparation du modèle de base de la muqueuse intestinale reconstruite en 3D REMARQUE : L’ensemble de la procédure doit être effectué dans une hotte à flux laminaire stérile. Toutes les étapes de la procédure impliquant l’utilisation de l’incubateur cellulaire signifient que les cultures sont incubées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 (sauf indication contraire dans le protocole). Préparation préalable des lign?…

Representative Results

Le premier aspect important est de déterminer l’acceptabilité de la muqueuse intestinale équivalente 3D de base à des fins expérimentales. Ceci est réalisé avec la coloration la plus largement utilisée dans les laboratoires d’histologie et d’histopathologie, à savoir l’hématoxyline (colore la matière nucléaire de couleur bleu-violet profond) et l’éosine (colore la matière cytoplasmique de différentes nuances de rose). La coloration H&E est d’abord réalisée sur un témoin non traité, qui est …

Discussion

Le système modèle de base de la muqueuse intestinale reconstruite présenté ici (Figure 6) combine la complexité physiologique (cultures cellulaires 3D plus pertinentes sur le plan physiologique contenant une monocouche Caco-2 avec un support de lamina propria riche en MEC contenant des fibroblastes et des monocytes) et la simplicité expérimentale (utilisation de lignées cellulaires humaines commerciales pour produire un système standardisé et facilement reproductible)<sup class="xr…