Bağışıklık Bileşenli Temel Üç Boyutlu (3D) Bağırsak Model Sistemi
Summary
Burada, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için temel bir üç boyutlu (3D) bağırsak hücre hattı model sistemi ve bir parafin gömme protokolü oluşturmayı açıklıyoruz. Seçilen proteinlerin boyanması, klinik öncesi ilaç tarama çalışmalarında potansiyel kullanım için tek bir deneyden birden fazla görsel parametrenin analizine izin verir.
Abstract
İnflamatuar bağırsak hastalıklarının patofizyolojisini incelemek, potansiyel olarak yararlı maddelerin farmakolojik taraması ve potansiyel olarak zararlı gıda bileşenleri üzerinde toksisite çalışmaları yapmak için in vivo ve in vitro bağırsak modellerinin kullanımında bir artış olmuştur. Konuyla ilgili olarak, hayvan modellerinin yerini almak için hücre bazlı in vitro modellerin geliştirilmesine yönelik mevcut bir talep vardır. Burada, hücre hatlarını kullanan temel, “sağlıklı doku” üç boyutlu (3D) bağırsak eşdeğeri modeli için bir protokol, hem deneysel basitlik (standartlaştırılmış ve kolayca tekrarlanabilir sistem) hem de fizyolojik karmaşıklık (U937 monositleri ve L929 fibroblastlarının destekleyici bir bağışıklık bileşenine sahip Caco-2 enterositleri) sağlamanın ikili yararı ile sunulmaktadır. Protokol ayrıca, sabit bağırsak eşdeğerlerinin ışık mikroskobik değerlendirmesi için parafin yerleştirmeyi de içerir, böylece tek bir deneyden birden fazla görsel parametreyi analiz etme avantajı sağlar. Hematoksilen ve eozin (H&E) ile boyanmış kesitler, Caco-2 kolumnar hücrelerinin kontrol tedavilerinde sıkı ve düzenli bir tek tabaka oluşturduğunu gösteren deneysel bir sistem olarak modelin etkinliğini doğrulamak için kullanılmıştır. Glüteni pro-inflamatuar bir gıda bileşeni olarak kullanarak, bölümlerden analiz edilen parametreler arasında azaltılmış tek tabaka kalınlığının yanı sıra altta yatan matristen (H & E) bozulma ve ayrılma, oklüdin boyamadan (istatistiksel olarak ölçülebilir) gösterildiği gibi sıkı bağlantı protein ekspresyonunun azalması ve farklılaşma 14 (CD14) boyama kümesinden ve CD11b ile ilişkili makrofajlara farklılaşmadan kanıtlandığı gibi göç eden U937 hücrelerinin bağışıklık aktivasyonu. Bağırsak iltihabını simüle etmek için lipopolisakkarit kullanılarak gösterildiği gibi, ölçülebilen ek parametreler, fiksasyondan önce ortamdan ekstrakte edilebilen artmış mukus boyaması ve sitokin ekspresyonudur (midkin gibi). Temel üç boyutlu (3D) bağırsak mukoza modeli ve sabit kesitler, birden fazla görsel ölçülebilir parametreyi analiz etme imkanı ile inflamatuar durum ve bariyer bütünlüğü çalışmaları için önerilebilir.
Introduction
Farklı tipte epitel hücreleri içeren tek hücre kalınlığında bir iç astar olan bağırsak epitel bariyeri, vücudun dış ve iç ortamı arasındaki ilk fiziksel savunma bariyerini veya arayüzünü oluşturur 1,2. Kolumnar tip enterositler, epitel hücrelerinin en bol bulunan tipini oluşturur. Bunlar, bariyer sıkılaştırmada önemli bir rol oynayan sıkı bağlantılar (TJ’ler) dahil olmak üzere çeşitli bariyer bileşenleri arasındaki etkileşimler yoluyla epitelyal bariyer bütünlüğünün korunmasından sorumludur 1,3. TJ yapısı, komşu hücreleri sıkıca birbirine bağlayan fermuar benzeri bir yapı oluşturan oklüdinler, kladinler ve eklemsel adezyon molekülleri (JAM’ler) dahil olmak üzere transmembran proteinlerle işbirliği yapan zonula okludens (ZO) ve singulin gibi hücre içi plak proteinlerinden oluşur 3,4. Transmembran proteinler, küçük bileşiklerin pasif paraselüler difüzyonunu düzenler ve toksik büyük molekülleri dışlar.
Potansiyel olarak toksik gıda bileşikleri ve gıda kontaminantları, epitel geçirgenliğini bozan, bağışıklık hücrelerini aktive eden ve kronik bağırsak dokusu iltihabına neden olan inflamatuar sitokin üretimini uyarır 5,6,7. Buna karşılık, çeşitli antioksidan ve antienflamatuar fitokimyasalların, inflamatuar sitokin ekspresyonunu azalttığı ve TJ protein ekspresyonunun ve montajınınrestorasyonu yoluyla bağırsak TJ bariyer bütünlüğünü arttırdığı bildirilmiştir 4,6,8. Bu nedenle, hem yararlı hem de zararlı bileşikler tarafından epitelyal bariyer bütünlüğünün düzenlenmesi, farmasötik tarama ve toksisite çalışmaları için bağırsak bariyerini taklit etmeyi amaçlayan hem in vivo hem de in vitro modellerin kullanımında bir artış görmüştür. Bu, deneysel modellerde simüle edilebilen bağırsak bağırsak hastalıkları (IBD), nekrotizan enterokolit ve kanserin patofizyolojisini anlamaya yönelik artan ilgi göz önüne alındığında özellikle önemlidir 8,9,10.
Hayvan testlerinde “3R” hedefine ulaşmak için hücre bazlı in vitro modellerin geliştirilmesine yönelik bir talep olmuştur. Bunlar, hayvanların kullanımına alternatif alternatifler, kullanılan hayvan sayısının azaltılması ve sıkıntıyı hafifleten yöntemlerin benimsenmesinde iyileştirmeyi içerir 11,12,13. Ayrıca, insan ve fare modelleri (kemirgenler en yaygın kullanılan türlerdir) arasındaki altta yatan moleküler, hücresel ve fizyolojik mekanizmalar ayırt edicidir ve fare modellerinin insan tepkilerinde öngörücü olarak etkinliği konusunda tartışmalara yol açar12,13. İn vitro insan hücre hattı modellerinin sayısız avantajı arasında hedef kısıtlamalı deney, doğrudan gözlem ve sürekli analizyer alır 13.
İki boyutlu (2D) kültürlerdeki tek hücre tipi tek katmanlar güçlü modeller olarak hizmet etmiştir. Bununla birlikte, bunlar insan dokularının fizyolojik karmaşıklığını tam olarak yeniden üretemez 8,13,14. Sonuç olarak, yeni nesil risk değerlendirme araç kutuları olarak hem sağlıklı hem de hastalıklı bağırsak dokularının fizyolojik karmaşıklığını özetlemek için sürekli artan iyileştirmelerle 3D kültür sistemleri geliştirilmektedir13,14. Bu modeller, hem hücre hatlarını hem de organoidleri (hem sağlıklı hem de hastalıklı dokulardan elde edilen) kullanan çeşitli hücre hatları, organoid kültürleri ve mikroakışkan cihazlara (çip üzerinde bağırsak) sahip 3D Transwell iskelelerini içerir8,13,14.
Bu çalışmada sunulan 3 boyutlu “sağlıklı doku” bağırsak eşdeğeri protokolü, fizyolojik karmaşıklık ve deneysel basitlik arasında bir denge kurmaya dayanmaktadır13. Model, üç hücre hattından (destekleyici bir bağışıklık bileşeni [U937 monositleri ve L929 fibroblastları] ile enterositler [altın standart kolon adenokarsinomu Caco-2 hattı]) oluşan bir 3D Transwell iskelesini temsil eder, standartlaştırılmış ve kolayca tekrarlanabilir bir sistem oluşturur. Protokol, sabit bağırsak eşdeğerleri kullanılarak epitelyal bariyer bütünlüğünün hafif mikroskobik değerlendirmesi için parafin yerleştirmeyi içerir. Mevcut yaklaşımın avantajı, gömülü dokuların çok sayıda bölümünün tek bir deneyden birden fazla parametre için boyanabilmesidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada sunulan temel yeniden yapılandırılmış bağırsak mukozası model sistemi (Şekil 6), fizyolojik karmaşıklığı (fibroblastlar ve monositler içeren ECM açısından zengin lamina propria desteğine sahip bir Caco-2 tek tabakası içeren fizyolojik olarak daha ilgili 3D hücre kültürleri) deneysel basitlikle (standartlaştırılmış ve kolayca tekrarlanabilir sistem üretmek için ticari insan hücre hatlarını kullanarak) birleştirir13. Bu nedenle,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Araştırmacı çalışmalarını destekleyen bir burs için Umberto Veronesi Vakfı’na teşekkürler.
References
- Chelakkot, C., Ghim, J., Ryu, S. H. Mechanisms regulating intestinal barrier integrity and its pathological implications. Experimental & Molecular Medicine. 50 (8), 1-9 (2018).
- Schoultz, I., Keita, &. #. 1. 9. 7. ;. V. The intestinal barrier and current techniques for the assessment of gut permeability. Cells. 9 (8), 1909 (1909).
- Bednarek, R. In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers. Methods and Protocols. 5 (1), 17 (2022).
- Suzuki, T. Regulation of the intestinal barrier by nutrients: The role of tight junctions. Animal Science Journal. 91 (1), e13357 (2020).
- Guibourdenche, M., et al. Food contaminants effects on an in vitro model of human intestinal epithelium. Toxics. 9 (6), 135 (2021).
- Panwar, S., Sharma, S., Tripathi, P. Role of barrier integrity and dysfunctions in maintaining the healthy gut and their health outcomes. Frontiers in Physiology. 12, 715611 (2021).
- Truzzi, F., et al. Pro-inflammatory effect of gliadins and glutenins extracted from different wheat cultivars on an in vitro 3D intestinal epithelium model. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 172 (2020).
- Fedi, A., et al. In vitro models replicating the human intestinal epithelium for absorption and metabolism studies: A systematic review. Journal of Controlled Release. 335, 247-268 (2021).
- De Fazio, L., et al. Necrotizing enterocolitis: Overview on in vitro models. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 6761 (2021).
- Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell & Bioscience. 12 (1), 155 (2022).
- Russell, W., Burch, R. The principles of humane experimental technique. Available online. , (2023).
- Ingber, D. E. Is it time for reviewer 3 to request human organ chip experiments instead of animal validation studies. Advanced Science. 7 (22), 2002030 (2020).
- Jung, S. M., Kim, S. In vitro models of the small intestine for studying intestinal diseases. Frontiers in Microbiology. 12, 767038 (2022).
- Nitsche, K. S., Müller, I., Malcomber, S., Carmichael, P. L., Bouwmeester, H. Implementing organ-on-chip in a next-generation risk assessment of chemicals: a review. Archives of Toxicology. 96 (3), 711-741 (2022).
- Kekilli, M., et al. Midkine level may be used as a noninvasive biomarker in Crohn’s disease. Turkish Journal of Medical Sciences. 50, 324-329 (2020).
- Truzzi, F., et al. Spermidine-eugenol supplement preserved inflammation-challenged intestinal cells by stimulating autophagy. International Journal of Molecular Sciences. 24 (4), 4131 (2023).
- Truzzi, F., et al. Are supplements safe? Effects of gallic and ferulic acids on in vitro cell models. Nutrients. 12 (6), 1591 (2020).
- Buckley, A. G., et al. Visualisation of multiple tight junctional complexes in human airway epithelial cells. Biological Procedures. Online. 20, 3 (2018).
- Ghosh, R., Gilda, J. E., Gomes, A. V. The necessity of and strategies for improving confidence in the accuracy of western blots. Expert Review of Proteomics. 11 (5), 549-560 (2014).
