רישום תקינות תפקודית של מחסום ב-bend.3 תאי אנדותל וסקולריים באמצעות זיהוי התנגדות חשמלית טרנסאנדותל
Summary
פרוטוקול זה מתאר מודל אמין ויעיל במבחנה של מחסום הדם במוח. השיטה משתמשת בתאי אנדותל של כלי דם מוחיים בעכבר bend.3 ומודדת התנגדות חשמלית טרנסממברנלית.
Abstract
מחסום הדם-מוח (BBB) הוא מבנה פיזיולוגי דינמי המורכב מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים, אסטרוציטים ופריציטים. על-ידי תיאום האינטראקציה בין מעבר מוגבל של חומרים מזיקים, ספיגת חומרים מזינים וסילוק מטבוליטים במוח, מחסום הדם-מוח חיוני לשימור הומאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. בניית מודלים חוץ גופיים של BBB היא כלי רב ערך לחקר הפתופיזיולוגיה של הפרעות נוירולוגיות ויצירת טיפולים תרופתיים. מחקר זה מתאר הליך ליצירת מודל תאי BBB חד-שכבתי במבחנה על ידי זריעת תאי bend.3 לתוך החדר העליון של צלחת בעלת 24 בארות. כדי להעריך את שלמות תפקוד מחסום התא, נעשה שימוש במד מתח תאי אפיתל קונבנציונלי כדי לרשום את ההתנגדות החשמלית הטרנסממברנה של תאים נורמליים ותאים היפוקסיים המושרים על ידי CoCl2 בזמן אמת. אנו צופים כי הניסויים הנ”ל יספקו רעיונות יעילים ליצירת מודלים חוץ גופיים של BBB ותרופות לטיפול בהפרעות של מחלות מערכת העצבים המרכזית.
Introduction
BBB הוא ממשק ביולוגי ייחודי בין מחזור הדם לרקמת העצב, המורכב מתאי אנדותל וסקולריים, פריציטים, אסטרוציטים, נוירונים ומבנים תאיים אחרים1. זרימת היונים, הכימיקלים והתאים בין הדם למוח מווסתת בקפדנות על ידי מחסום זה. הומאוסטזיס זה מגן על רקמות העצבים מפני רעלים ופתוגנים תוך שהוא מאפשר פעולה מתאימה של עצבי המוח 2,3. שמירה על שלמות BBB יכולה למנוע ביעילות התפתחות והתקדמות של הפרעות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית, כגון תפקוד עצבי, בצקת ודלקת עצבית4. עם זאת, התכונות הפיזיולוגיות הייחודיות של BBB מונעות מיותר מ-98% מהתרופות במולקולות קטנות ומ-100% מהתרופות המקרומולקולאריות להיכנס למערכת העצבים המרכזית5. לכן, הגברת החדירה של תרופות דרך BBB במהלך פיתוח תרופות למערכת העצבים המרכזית חיונית להשגת יעילות טיפולית 6,7. אף על פי שסימולציה ממוחשבת של מצעים העלתה באופן משמעותי את ההסתברות של מועמדים לתרופות לחצות את מחסום הדם-מוח, עדיין נדרשים מודלים אמינים ובמחיר סביר של BBB in vitro/in vivo כדי לענות על צרכי המחקר המדעי8.
טכניקה מהירה ומשתלמת לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה היא מודל 9 במבחנה. כדי לשפוך אור על התהליכים הבסיסיים של השפעות התרופות על תפקוד BBB וחלקם בהתפתחות והתקדמות המחלה, נוצרה סדרה של מודלים פשוטים של BBB במבחנה. כיום, המודלים הנפוצים של BBB במבחנה הם מודלים חד-שכבתיים, תרבית משותפת, דינמיים ומיקרופלואידים 10,11,12, שנבנו על ידי תאי אנדותל וסקולריים ואסטרוציטים, פריציטים או מיקרוגליה 13,14. למרות שתרביות תאים תלת-ממדיות תואמות יותר את המבנה הפיזיולוגי של BBB15, היישום שלהן כאמצעי לסינון תרופות עבור BBB עדיין מוגבל על ידי העיצוב המורכב שלהן ויכולת השחזור שלהן. לעומת זאת, המודל החד-שכבתי במבחנה הוא המודל הנפוץ ביותר לחקר BBB והוא ישים לקביעת הביטוי של מובילי ממברנות וחלבוני צומת הדוקים בתאים מסוימים.
מדידת התנגדות חשמלית טרנסממברנה (TEER) היא טכניקה להערכה וניטור של שכבת התאים על פני ההתנגדות והערכת שלמות התא וחדירות המחסום. על ידי החדרה בו זמנית של שתי אלקטרודות למדיום הגידול או לתמיסת החיץ משני צדי החד-שכבה, ניתן למדוד את זרם החילופין או העכבה החשמלית דרך השכבה הקומפקטית16,17 של התא. על מנת לקבוע אם מודל BBB במבחנה נוצר כראוי, המדידה של TEER תשמש בדרך כלל כתקן זהב18. מצד שני, ניתן לחזות במדויק את מגמת הפעולה התרופתית על חדירות BBB על ידי מדידת השינוי בהתנגדות החשמלית של שכבת התא לאחר מעורבות סמים19. לדוגמה, פנג ועמיתיו גילו כי קטלפול (המונומר הפעיל העיקרי של rehmanniae) יכול להפוך ביעילות את הוויסות כלפי מטה המושרה על ידי ליפופוליסכריד של חלבוני צומת הדוקים ב- BBB ולהעלות את ערך TEER של שכבת תאי אנדותל במוח העכבר20.
התגובה הנוירו-דלקתית היא בדרך כלל הגורם העיקרי לחוסר איזון בהומאוסטזיס BBB21. טיפול היפוקסי לגרימת פגיעה נוירו-דלקתית הוא השיטה העיקרית להרוס את מחסום הדם-מוח, בעיקר כולל שיטות פיזיות ושיטות ריאגנטים כימיים. הראשון משתמש בעיקר באינקובטור של שלושה גזים כדי לשנות את תכולת החמצן בסביבת גידול התאים כדי לדמות תנאים היפוקסיים22, ואילו האחרון מושג על ידי החדרה מלאכותית של ריאגנטים deoxy כגון CoCl2 למדיום תרבית התא23. התאים יישארו במצב לא מחומצן אם Fe2+ יוחלף ב- Co2+ ב- heme. אם Fe2+ מוחלף ב- Co2+ בקבוצה הקטליטית, פעילות הידרוקסילאז פרולין והידרוקסילאז אספרטט יעוכבו, וכתוצאה מכך הצטברות של גורם השראת היפוקסיה-1α (HIF-1α)24. תחת היפוקסיה מתמשכת, dephosphorylation של HIF-1α בציטופלסמה מעורר מוות התא ומפעיל גורם גדילה אנדותל כלי הדם, אשר בסופו של דבר מעלה חדירות כלי הדם. במחקרים קודמים 25,26, הוכח היטב כי היפוקסיה יכולה להפחית באופן משמעותי את הביטוי של חלבוני צומת הדוק אנדותל כדי להגדיל את החדירות של BBB. במחקר זה נמדדה עקומת התנגדות הזמן של תאי bend.3 שנזרעו בלוחות של 24 בארות על מנת ליצור מודל BBB פשוט. באמצעות מודל זה, אפיינו את השינויים ב-TEER התא לאחר התערבות CoCl2 על מנת לבנות מודל תאי שניתן להשתמש בו כדי לסנן תרופות להגנה מפני BBB.
Protocol
Representative Results
Discussion
אחד מאיברי הגוף המפותחים ביותר, המוח שולט במגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים מורכבים, כולל זיכרון, קוגניציה, שמיעה, ריח ותנועה27. המוח הוא אחד האיברים המסובכים והמטופלים ביותר בגוף האדם בעת ובעונה אחת. הופעתן של הפרעות רבות במערכת העצבים המרכזית מראה נטייה גוברת משנה לשנה בשל ג?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מעריכים את התמיכה הכספית מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82274207 ו- 82104533), תוכנית המחקר והפיתוח המרכזית של נינגשיה (2023BEG02012), ופרויקט קידום המחקר המלומד Xinglin של אוניברסיטת צ’נגדו של TCM (XKTD2022013).
Materials
| 24-well transwell plate | Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) | 10522023 | |
| 75 % ethanol | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2023052901 | |
| 96-well plate | Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd | 220412-078-B | |
| bEnd.3 cells | Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd | CL0049 | |
| Cell counting kit-8 (CCK-8) | Boster Biological Technology Co., Ltd | BG0025 | |
| Cell culture dish (100mm) | Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd | 1192022 | |
| Cobalt Chloride (CoCl2) | Sigma | 15862 | |
| DMSO | Boster Biological Technology Co., Ltd | PYG0040 | |
| Dulbecco's modified eagle medium (1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8121587 | |
| Fetal bovine serum | Gibco ThermoFisher Scientific | 2166090RP | |
| GraphPad Prism software | GraphPad Software | 9.0.0(121) | |
| Matrigel (Contains collagen IV) | MedChemexpress | HY-K6002 | |
| Microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax iD5 | |
| OriginPro 8 software | OriginLab Corporation | v8.0724(B724) | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Boster Biological Technology Co., Ltd | 17C18B16 | |
| Phosphate buffered saline (PBS, 1x) | Gibco ThermoFisher Scientific | 8120485 | |
| Sodium hypochlorite | ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd | 2022091501 | |
| Transmembrane resistance meter | World Precision Instruments LLC | VOM3 (verison 1.6) | |
| Trypsin 0.25% (1x) | HyClone | J210045 |
References
- Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
- Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
- Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412 (2015).
- Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
- Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).
- Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
- Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
- Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
- Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, &. #. 3. 5. 0. ;., ÖztÜrk, &. #. 3. 5. 0. ;., Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
- Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
- Aazmi, A., et al. Vascularizing the brain in vitro. iScience. 25 (4), 104110 (2022).
- Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
- Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
- Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
- Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
- Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
- Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
- Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
- Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
- Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
- Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
- Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
- Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
- Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
- Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
- Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
- Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
- Alzheimers Dement. Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
- Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
- Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
- Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer’s Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
- Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
- Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
- Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
- Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
- Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
- Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).
