JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
自动翻译
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
神经科学

bEnd.3 Transendotelyal Elektriksel Direnç Tespiti Yoluyla Vasküler Endotel Hücrelerinde Bariyer Fonksiyonel Bütünlük Kaydı

Published: September 29, 2023
doi:
10.3791/65938
, , , , , , ,
1School of Pharmacy/School of Modern Chinese Medicine Industry,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4School of Pharmacy,Ningxia Medical University, 5Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy/Academy for Interdiscipline,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Bu protokol, beyin kan bariyerinin güvenilir ve verimli bir in vitro modelini tanımlar. Yöntem, fare serebral vasküler endotel hücreleri bEnd.3’ü kullanır ve transmembran elektrik direncini ölçer.

Abstract

Kan-beyin bariyeri (BBB), mikrovasküler endotel hücreleri, astrositler ve perisitlerden oluşan dinamik bir fizyolojik yapıdır. Zararlı maddelerin sınırlı geçişi, besin emilimi ve beyindeki metabolit klirensi arasındaki etkileşimi koordine ederek, BBB merkezi sinir sistemi homeostazının korunmasında esastır. BBB’nin in vitro modellerini oluşturmak, nörolojik bozuklukların patofizyolojisini araştırmak ve farmakolojik tedaviler oluşturmak için değerli bir araçtır. Bu çalışma, bEnd.3 hücrelerini 24 oyuklu bir plakanın üst odasına tohumlayarak in vitro tek katmanlı bir BBB hücre modeli oluşturmak için bir prosedürü açıklamaktadır. Hücre bariyeri fonksiyonunun bütünlüğünü değerlendirmek için, normal hücrelerin ve CoCl2 ile indüklenen hipoksik hücrelerin transmembran elektrik direncini gerçek zamanlı olarak kaydetmek için geleneksel epitel hücre voltmetresi kullanıldı. Yukarıdaki deneylerin, merkezi sinir sistemi hastalıklarının bozukluklarını tedavi etmek için in vitro BBB ve ilaç modellerinin oluşturulması için etkili fikirler sağlayacağını tahmin ediyoruz.

Introduction

BBB, vasküler endotel hücreleri, perisitler, astrositler, nöronlar ve diğer hücresel yapılardan oluşan kan dolaşımı ve sinir dokusu arasında benzersiz bir biyolojik arayüzdür1. Kan ve beyin arasındaki iyonların, kimyasalların ve hücrelerin akışı bu bariyer tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. Bu homeostaz, sinir dokularını toksinlere ve patojenlere karşı korurken, aynı zamanda beyin sinirlerinin uygun şekilde çalışmasını sağlar 2,3. BBB’nin bütünlüğünün korunması, nöronal disfonksiyon, ödem ve nöroinflamasyon gibi merkezi sinir sistemini etkileyen bozuklukların gelişmesini ve ilerlemesini etkili bir şekilde önleyebilir4. Bununla birlikte, BBB’nin benzersiz fizyolojik özellikleri, küçük moleküllü ilaçların% 98’inden fazlasının ve makromoleküler farmasötiklerin% 100’ünün merkezi sinir sistemine girmesini önler5. Bu nedenle, merkezi sinir sistemi için ilaçların geliştirilmesi sırasında ilaçların BBB yoluyla penetrasyonunun arttırılması, terapötik etkinliğin elde edilmesi için esastır 6,7. Substratların bilgisayar simülasyonu taraması, ilaç adaylarının BBB’yi geçme olasılığını önemli ölçüde artırmış olsa da, bilimsel araştırma ihtiyaçlarını karşılamak için hala güvenilir ve uygun fiyatlı in vitro/in vivo BBB modellerine ihtiyaç vardır8.

Yüksek verimli ilaç taraması için hızlı ve uygun fiyatlı bir teknik, in vitro model9’dur. İlaçların BBB fonksiyonu üzerindeki etkilerinin temel süreçlerine ve hastalığın gelişimi ve ilerlemesindeki rollerine ışık tutmak için bir dizi basitleştirilmiş in vitro BBB modeli oluşturulmuştur. Şu anda, yaygın in vitro BBB modelleri, vasküler endotel hücreleri ve astrositler, perisitler veya mikroglia13,14 tarafından oluşturulan tek katmanlı, ko-kültür, dinamik ve mikroakışkan modellerdir 10,11,12. Her ne kadar 3D hücre kültürleri BBB15’in fizyolojik yapısı ile daha uyumlu olsa da, BBB için bir ilaç tarama aracı olarak uygulamaları, karmaşık tasarımları ve ortalamanın altında tekrarlanabilirlikleri nedeniyle hala kısıtlanmaktadır. Buna karşılık, tek katmanlı in vitro model, BBB’yi araştırmak için en sık kullanılan modeldir ve belirli hücrelerde membran taşıyıcılarının ve sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunu belirlemek için uygulanabilir.

Transmembran elektrik direnci (TEER) ölçümü, direnç boyunca hücre katmanını değerlendirmek ve izlemek ve bariyerin hücre bütünlüğünü ve geçirgenliğini değerlendirmek için kullanılan bir tekniktir. Tek tabakanın her iki tarafındaki büyüme ortamına veya tampon çözeltisine aynı anda iki elektrot yerleştirerek, hücrenin kompakt tabakası16,17 boyunca alternatif akımı veya elektrik empedansını ölçmek mümkündür. İn vitro BBB modelinin uygun şekilde oluşturulup oluşturulmadığını belirlemek için, TEER ölçümü genellikle altın standart18 olarak kullanılacaktır. Öte yandan, BBB geçirgenliği üzerindeki ilaç etkisinin eğilimi, ilaç tutulumundan sonra hücre tabakasının elektrik direncindeki değişimin ölçülmesiyle doğru bir şekilde tahmin edilebilir19. Örneğin, Feng ve ark. katalpolün (rehmanniae’nin birincil aktif monomeri), BBB’deki sıkı bağlantı proteinlerinin lipopolisakkarit kaynaklı aşağı regülasyonunu etkili bir şekilde tersine çevirebileceğini ve fare beyni endotel hücre tabakasınınTEER değerini 20 yükseltebileceğini keşfetti.

Nöroinflamatuar yanıt genellikle BBB homeostaz dengesizliğinin ana nedenidir21. Nöroinflamatuar hasarı indüklemek için hipoksik tedavi, esas olarak fiziksel yöntemler ve kimyasal reaktif yöntemleri dahil olmak üzere kan-beyin bariyerini yok etmenin ana yöntemidir. İlki, hipoksik koşulları22 simüle etmek için hücre büyüme ortamındaki oksijen içeriğini değiştirmek için öncelikle üç gazlı bir inkübatör kullanırken, ikincisi, CoCl2 gibi deoksi reaktiflerinin hücre kültürü ortamına23 yapay olarak sokulmasıyla elde edilir. Fe2 + Co2 + ile ikame edilirse hücreler oksijensiz bir durumda kalacaktır 2 + heme’de. Katalitik grupta Co2+ yerine Fe2+ ikame edilirse, prolin hidroksilaz ve aspartat hidroksilaz aktivitesi inhibe edilecek ve hipoksi ile indüklenebilir faktör-1α (HIF-1α) birikimine neden olacaktır24. Kalıcı hipoksi altında, sitoplazmada HIF-1α’nın fosforilasyonu hücre ölümünü tetikler ve sonuçta vasküler geçirgenliği artıran vasküler endotelyal büyüme faktörünü aktive eder. Önceki çalışmalarda 25,26, hipoksinin BBB’nin geçirgenliğini artırmak için endotelyal sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunu önemli ölçüde azaltabileceği iyi gösterilmiştir. Bu çalışmada, basit bir BBB modeli oluşturmak için 24 oyuklu plakalara ekilen bEnd.3 hücrelerinin zaman-direnç eğrisi ölçülmüştür. Bu modeli kullanarak, BBB koruması için ilaçları taramak için kullanılabilecek bir hücre modeli oluşturmak için CoCl2 müdahalesinden sonra hücre TEER’sindeki değişiklikleri karakterize ettik.

Protocol

NOT: Fare beyninden türetilen Endotel hücreleri.3 (bEnd.3), belirli ortam koşulları altında basit bir in vitro BBB modeli oluşturmak için 24 oyuklu bir plakanın odalarına aşılandı. Normal hücrelerin ve hipoksik hücrelerin TEER metresi ile ölçüldü (Şekil 1 ve Şekil 2). 1. Çözelti hazırlama FBS (% 10, v / v), 100 U / mL penisilin ve 10 mg / mL streptomisin içeren DMEM hücre k?…

Representative Results

Bu protokol, transendotelyal direnç ölçerde ayarlanan parametrelere göre hücrelerin direnç değerlerindeki değişikliklerin kaydedilmesine izin verdi. Farklı konsantrasyonlarda CoCl2 ile muamele edilen bEnd.3 hücrelerinin (canlı hücre sayısı) canlılığı CCK-8 testi ile tarandı. CoCl2 tarafından üretilen daha büyük hücre hasarı, daha düşük hücre canlılığı ile temsil edildi. 300 μMCoCl2’nin in vitro olarak önemli ölçüde sitotoksik olduğunu buldu…

Discussion

En gelişmiş vücut organlarından biri olan beyin, hafıza, biliş, işitme, koku alma ve hareket dahil olmak üzere çok çeşitli karmaşık fizyolojik süreçleri kontrol eder27. Beyin aynı zamanda insan vücudunun en karmaşık ve hastalıklı organlarından biridir. Birçok merkezi sinir sistemi bozukluğunun ortaya çıkması, hava kirliliği, düzensiz beslenme alışkanlıkları ve diğer faktörler gibi faktörlere bağlı olarak yıldan yıla artan bir eğilim göstermektedir 27,28,29…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı’nın (82274207 ve 82104533), Ningxia’nın Temel Araştırma ve Geliştirme Programı’nın (2023BEG02012) ve TCM Chengdu Üniversitesi’nin (XKTD2022013) Xinglin Scholar Araştırma Teşvik Projesi’nin mali desteğini takdir ediyoruz.

Materials

24-well transwell plate Corning (Corning 3470, 0.33 cm2, 0.4 µm) 10522023
75 % ethanol ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2023052901
96-well plate Guangzhou Jet Bio-Filtration Co., Ltd 220412-078-B
bEnd.3 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0049
Cell counting kit-8 (CCK-8) Boster Biological Technology Co., Ltd BG0025
Cell culture dish (100mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cobalt Chloride (CoCl2) Sigma 15862
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8121587
Fetal bovine serum Gibco ThermoFisher Scientific 2166090RP
GraphPad Prism software GraphPad Software 9.0.0(121)
Matrigel (Contains collagen IV) MedChemexpress HY-K6002
Microplate reader Molecular Devices SpectraMax iD5
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
Phosphate buffered saline (PBS, 1x) Gibco ThermoFisher Scientific 8120485
Sodium hypochlorite ChengDu Chron Chemicals Co,.Ltd 2022091501
Transmembrane resistance meter World Precision Instruments LLC VOM3 (verison 1.6)
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, Y., et al. CLEC14A deficiency exacerbates neuronal loss by increasing blood-brain barrier permeability and inflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 48 (2020).
  2. Bagchi, S., et al. In-vitro blood-brain barrier models for drug screening and permeation studies: an overview. Drug Des Devel Ther. 13, 3591-3605 (2019).
  3. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harb perspect Biol. 7 (1), 020412 (2015).
  4. Profaci, C. P., Munji, R. N., Pulido, R. S., Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease: Important unanswered questions. J Exp Med. 217 (4), 20190062 (2020).
  5. Pardridge, W. M. Blood-brain barrier delivery. Drug Discov Today. 12 (1-2), 54-56 (2007).
  6. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 33 (2013).
  7. Gajdács, M. The concept of an ideal antibiotic: Implications for drug design. Molecule. 24 (5), 892 (2019).
  8. Stanimirovic, D. B., Bani-Yaghoub, M., Perkins, M., Haqqani, A. S. Blood-brain barrier models: in vitro to in vivo translation in preclinical development of CNS-targeting biotherapeutics. Expert Opin Drug Discov. 10 (2), 141-155 (2015).
  9. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  10. Özyurt, M. G., Bayir, E., DoĞan, &. #. 3. 5. 0. ;., ÖztÜrk, &. #. 3. 5. 0. ;., Şendemİr, A. Coculture model of blood-brain barrier on electrospun nanofibers. Turk J Biol. 44 (4), 121-132 (2020).
  11. Kim, W., et al. Functional validation of the simplified in vitro 3D Co-culture based BBB model. Biochem Biophys Res Commun. 625, 128-133 (2022).
  12. Aazmi, A., et al. Vascularizing the brain in vitro. iScience. 25 (4), 104110 (2022).
  13. Burkhart, A., et al. Transfection of brain capillary endothelial cells in primary culture with defined blood-brain barrier properties. Fluids Barriers CNS. 12, 19 (2015).
  14. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  15. Peng, Y., et al. Neuroinflammatory in vitro cell culture models and the potential applications for neurological disorders. Front Pharmacol. 12, 671734 (2021).
  16. Secker, P. F., Schlichenmaier, N., Beilmann, M., Deschl, U., Dietrich, D. R. Functional transepithelial transport measurements to detect nephrotoxicity in vitro using the RPTEC/TERT1 cell line. Arch Toxicol. 93 (7), 1965-1978 (2019).
  17. Nazari, H., et al. Advances in TEER measurements of biological barriers in microphysiological systems. Biosens Bioelectron. 234, 115355 (2023).
  18. Nicolas, A., et al. High throughput transepithelial electrical resistance (TEER) measurements on perfused membrane-free epithelia. Lab Chip. 21 (9), 1676-1685 (2021).
  19. Yang, Z., et al. Autophagy alleviates hypoxia-induced blood-brain barrier injury via regulation of CLDN5 (claudin 5). Autophagy. 17 (10), 3048-3067 (2021).
  20. Feng, S., et al. RhoA/ROCK-2 pathway inhibition and tight junction protein upregulation by catalpol suppresses lipopolysaccaride-induced disruption of blood-brain barrier permeability. Molecules. 23 (9), (2018).
  21. Sulhan, S., Lyon, K. A., Shapiro, L. A., Huang, J. H. Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury: Pathophysiology and potential therapeutic targets. J Neurosci Res. 98 (1), 19-28 (2020).
  22. Liu, B., et al. Notoginsenoside R1 intervenes degradation and redistribution of tight junctions to ameliorate blood-brain barrier permeability by Caveolin-1/MMP2/9 pathway after acute ischemic stroke. Phytomedicine. 90, 153660 (2021).
  23. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568 (2023).
  24. Muñoz-Sánchez, J., Chánez-Cárdenas, M. E. The use of cobalt chloride as a chemical hypoxia model. J Appl Toxicol. 39 (4), 556-570 (2019).
  25. Jiang, S., et al. Salidroside attenuates high altitude hypobaric hypoxia-induced brain injury in mice via inhibiting NF-κB/NLRP3 pathway. Eur J Pharmacol. 925, 175015 (2022).
  26. Xie, N., et al. Rhodiola crenulate alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury via adjusting NF-κB/NLRP3-mediated inflammation. Phytomedicine. 103, 154240 (2022).
  27. Thiebaut de Schotten, M., Forkel, S. J. The emergent properties of the connected brain. Science. 378 (6619), 505-510 (2022).
  28. Tu, W. J., et al. Estimated burden of stroke in China in 2020. JAMA Netw Open. 6 (3), 231455 (2023).
  29. Alzheimers Dement. Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimers Dement. 17 (3), 327-406 (2021).
  30. Wang, R., et al. Neutrophil extracellular traps promote tPA-induced brain hemorrhage via cGAS in mice with stroke. Blood. 138 (1), 91-103 (2021).
  31. Liu, X. X., et al. Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis. J Exp Med. 217 (1), 20180992 (2020).
  32. Chen, X., et al. Modeling Sporadic Alzheimer’s Disease in Human Brain Organoids under Serum Exposure. Adv Sci (Weinh). 8 (18), 2101462 (2021).
  33. Qi, D., Lin, H., Hu, B., Wei, Y. A review on in vitro model of the blood-brain barrier (BBB) based on hCMEC/D3 cells. J Control Release. 358, 78-97 (2023).
  34. Artus, C., et al. The Wnt/planar cell polarity signaling pathway contributes to the integrity of tight junctions in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (3), 433-440 (2014).
  35. Sivandzade, F., Cucullo, L. In-vitro blood-brain barrier modeling: A review of modern and fast-advancing technologies. J Cereb Blood Flow Metab. 38 (10), 1667-1681 (2018).
  36. Galla, H. J. Monocultures of primary porcine brain capillary endothelial cells: Still a functional in vitro model for the blood-brain-barrier. J Control Release. 285, 172-177 (2018).
  37. Srinivasan, B., Kolli, A. R. Transepithelial/transendothelial electrical resistance (TEER) to measure the integrity of blood-brain barrier. Blood-Brain Barrier. 142, 99-114 (2019).
  38. Liang, Y., Yoon, J. Y. In situ sensors for blood-brain barrier (BBB) on a chip. Sens Actuators Rep. 3, 100031 (2021).
  39. Ozgür, B., Helms, H. C. C., Tornabene, E., Brodin, B. Hypoxia increases expression of selected blood-brain barrier transporters GLUT-1, P-gp, SLC7A5 and TFRC, while maintaining barrier integrity, in brain capillary endothelial monolayers. Fluids Barriers CNS. 19 (1), (2022).

Tags

Keywords: Blood-brain BarrierBBB ModelBEnd.3 CellsTransendothelial Electrical Resistance (TEER)Barrier IntegrityCell PermeabilityIn Vitro ModelCentral Nervous SystemDrug ScreeningHypoxia
check_url/cn/65938?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fan, F., Jiang, H., Hou, Y., Zhang, Y., Zhao, Q., Zeng, Y., Meng, X., Wang, X. Barrier Functional Integrity Recording on bEnd.3 Vascular Endothelial Cells via Transendothelial Electrical Resistance Detection. J. Vis. Exp. (199), e65938, doi:10.3791/65938 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image