Summary

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Published: December 22, 2023
doi:

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes 3D-System zur Induktion neuronaler Netzhaut, das die Adhäsion und Fusion von Netzhautorganoiden mit hoher Wiederholbarkeit und Effizienz reduziert.

Abstract

Die Retinopathie ist weltweit eine der Hauptursachen für Erblindung. Die Untersuchung seiner Pathogenese ist für die frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung der Retinopathie unerlässlich. Leider behindern ethische Barrieren das Sammeln von Beweisen von Menschen. In jüngster Zeit haben zahlreiche Studien gezeigt, dass humane pluripotente Stammzellen (PSCs) unter Verwendung verschiedener Induktionsprotokolle in retinale Organoide (ROs) differenziert werden können, die in der Retinopathie ein enormes Potenzial für die Krankheitsmodellierung, das Wirkstoffscreening und stammzellbasierte Therapien haben. Diese Studie beschreibt ein optimiertes Induktionsprotokoll zur Erzeugung einer neuralen Netzhaut (NR), das die Wahrscheinlichkeit von Vesikulation und Fusion signifikant reduziert und die Erfolgsrate der Produktion bis zum 60. Tag erhöht. Basierend auf der Fähigkeit von PSCs, sich nach der Dissoziation selbst zu reorganisieren, kombiniert mit bestimmten komplementären Faktoren, kann diese neue Methode die NR-Differenzierung spezifisch vorantreiben. Darüber hinaus ist der Ansatz unkompliziert, kostengünstig, weist eine bemerkenswerte Wiederholbarkeit und Effizienz auf, bietet ermutigende Aussichten für personalisierte Modelle von Netzhauterkrankungen und bietet ein reichliches Zellreservoir für Anwendungen wie Zelltherapie, Wirkstoffscreening und Gentherapietests.

Introduction

Das Auge dient als primäre Informationsquelle unter den menschlichen Sinnesorganen, wobei die Netzhaut das wichtigste visuelle Sinnesgewebe in Säugetieraugen ist1. Retinopathie ist eine der wichtigsten globalen Ursachen für Augenkrankheiten, die zur Erblindung führen2. Weltweit leiden etwa 2,85 Millionen Menschen an unterschiedlich starken Sehstörungen aufgrund einer Retinopathie3. Daher ist die Untersuchung seiner Pathogenese entscheidend für eine frühzeitige Diagnose und rechtzeitige Behandlung. Die meisten Studien zur menschlichen Retinopathie haben sich hauptsächlich auf Tiermodelle konzentriert 4,5,6. Die menschliche Netzhaut ist jedoch ein komplexes, vielschichtiges Gewebe, das aus verschiedenen Zelltypen besteht. Herkömmliche zweidimensionale (2D) Zellkultur- und Tiermodellsysteme sind in der Regel nicht in der Lage, die normale räumlich-zeitliche Entwicklung und den Arzneimittelstoffwechsel der nativen menschlichen Netzhaut originalgetreu zu rekapitulieren 7,8.

In jüngster Zeit haben sich 3D-Kulturtechniken entwickelt, um gewebeähnliche Organe aus pluripotenten Stammzellen (PSCs) zu erzeugen9,10. Retinale Organoide (ROs), die aus menschlichen PSCs in einem 3D-Suspensionskultursystem erzeugt werden, enthalten nicht nur sieben retinale Zelltypen, sondern weisen auch eine ausgeprägte geschichtete Struktur auf, die der menschlichen Netzhaut in vivo ähnelt 11,12,13. Humane PSC-abgeleitete ROs haben an Popularität und weit verbreiteter Verfügbarkeit gewonnen und sind derzeit die besten In-vitro-Modelle zur Untersuchung der Entwicklung und Erkrankung der menschlichen Netzhaut14,15. In den letzten Jahrzehnten haben zahlreiche Forscher gezeigt, dass sich menschliche PSCs, einschließlich embryonaler Stammzellen (ESCs) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs), mithilfe verschiedener Induktionsprotokolle in ROs differenzieren können. Diese Fortschritte bergen ein enormes Potenzial in der Retinopathie für die Krankheitsmodellierung, das Wirkstoffscreening und stammzellbasierte Therapien 16,17,18.

Die Erzeugung von neuronaler Netzhaut (NR) aus humanen pluripotenten Stammzellen (PSCs) ist jedoch ein komplexer, umständlicher und zeitaufwändiger Prozess. Darüber hinaus können Variationen von Charge zu Charge bei Gewebeorganoiden zu einer geringeren Reproduzierbarkeit der Ergebnisse führen 19,20. Zahlreiche intrinsische und extrinsische Faktoren können die Ausbeute an retinalen Organoiden (ROs) beeinflussen, wie z. B. die Anzahl oder Spezies der Ausgangszellen und die Verwendung von Transkriptionsfaktoren und niedermolekularen Verbindungen 21,22,23. Seit der Erzeugung der ersten menschlichen RO durch das Sasai-Labor11 wurden im Laufe der Jahre mehrere Modifikationen vorgeschlagen, um die Einfachheit und Wirksamkeit des Induktionsprozesses zu verbessern 13,21,24,25. Leider wurde bis heute kein Goldstandardprotokoll für die Erzeugung von ROs in allen Labors festgelegt. In der Tat gibt es ein gewisses Maß an Diskrepanz bei ROs, das sich aus verschiedenen Induktionsmethoden ergibt, sowie große Unterschiede in der Expression von Netzhautmarkern und der Robustheit ihrer Struktur22,26. Diese Probleme können die Probenentnahme und die Interpretation der Studienergebnisse erheblich erschweren. Daher ist ein konsolidierteres und robusteres Differenzierungsprotokoll erforderlich, um die Effizienz bei minimaler Heterogenität der RO-Erzeugung zu maximieren.

Diese Studie beschreibt ein optimiertes Induktionsprotokoll, das auf einer Kombination von Kuwahara et al.12 und Döpper et al.27 mit detaillierten Anweisungen basiert. Die neue Methode reduziert die Wahrscheinlichkeit der Organoidvesikulation und -fusion signifikant und erhöht die Erfolgsrate bei der Erzeugung von NR. Diese Entwicklung ist vielversprechend für die Modellierung von Krankheiten, das Screening von Medikamenten und Zelltherapieanwendungen für Netzhauterkrankungen.

Protocol

Diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den Grundsätzen der Deklaration von Helsinki durchgeführt und von der institutionellen Ethikkommission des chinesischen Allgemeinen Krankenhauses der Volksbefreiungsarmee genehmigt. Die WA09 (H9) ESC-Linie wurde vom WiCell Research Institute bezogen. 1. Nährmedien und Reagenzienvorbereitung Humanes ESC-Nährmedium und DurchgangslösungErhaltungsmedium (MM): 500 ml vollständiges MM (Basalmedium + 5x Ergänzung; si…

Representative Results

Eine grafische Übersicht über das geänderte Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. H9-ESCs wurden zur Erzeugung von ROs verwendet, wenn die Zellen auf eine Dichte von 70 % bis 80 % gezüchtet wurden. Einzelzellsuspensionen von H9-ESCs in konischen Vertiefungen mit 96 V-Boden aggregierten sich an Tag 1 und bildeten bis Tag 6 gut umschriebene runde EBs. Mit zunehmender Kulturzeit nahm das Volumen der EBs allmählich zu. Am Tag 30 wurden während der langfristigen NR-Differenzierung deutl…

Discussion

Menschliche ROs können die Entwicklung der fetalen Netzhaut räumlich und zeitlich rekapitulieren, und frühe ROs weisen in äquivalenten Entwicklungsstadien einen hohen Grad an Ähnlichkeit mit der fetalen Netzhaut auf15. In Bezug auf Gewebemorphologie und molekulare Expression spiegelt die menschliche RO den tatsächlichen Wachstumsstatus des Netzhautgewebes genau wider und bietet enorme und beispiellose Möglichkeiten in den Bereichen Krankheitsmodellierung, Wirkstoffscreening und regenerative…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nichts.

Materials

0.01 M TPBS Servicebio G0002 Washing slices
4% Paraformaldehyde Servicebio G1101-500ML Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette NEST Biotechnology 318516 Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells Sumitomo Bakelit MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides CITOTEST 188105 Fix slices
AggreWell medium STEMCELL Technologies 5893 Medium
Anhydrous ethanol SINOPHARM 10009218 Dehydrate 
Anti-CHX10 Santa Cruz sc-365519 Primary antibody
Antifade Solution ZSGB-BIO ZLI-9556
Anti-KI67 Abcam ab16667 Primary antibody
Anti-NESTIN Sigma N5413 Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) Beyotime AT809 Primary antibody
Anti-PAX6 Abcam ab195045 Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS) STEMCELL Technologies 7922 Cell dissociation
CHIR99021 Selleckchem S2924 GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate Gibco 12531018 250×
Citrate Antigen Retrieval Solution Servicebio G1202-250ML 20×, pH 6.0
CS10 STEMCELL Technologies 1001061 Cell Freezing Medium
DAPI Roche 10236276001 Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 11330032 Medium
DMEM/F12-GlutaMAX Gibco 10565018 Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 Invitrogen A32766 Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A10042 Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Biosharp BL518A 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM) Corning 354277 Coating plates
F12-Glutamax Gibco 31765035 Medium
Fetal Bovine Serum Gibco A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer TissueGnostics TissueFAXS Plus Scan sections
IMDM-GlutaMAX Gibco 31980030 Medium
IWR1-endo Selleckchem S7086 Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028
LDN-193189 2HCl Selleckchem S7507 BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates Corning 3473
Low-adhesion 6-well Plates Corning 3471
Maintenance medium (MM) STEMCELL Technologies 85850 Medium
N2 supplement Gibco 17502048
Normal Donkey Serum Solarbio SL050 Blocking buffer
Paraplast Leica 39601006 Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x) Gibco C10010500BT Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) R&D 314-BP Key protein factor
Retinoic acid Sigma R2625 Powder, keep out of light
SB431542 Selleckchem S1067 ALK5-inhibitor
SU5402 Selleckchem S7667 Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen ZSGB-BIO ZLI-9305
Taurine Sigma T0625-10G
Thioglycerol Sigma M1753
Triton X-100 Sigma X100 Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line WiCell Research Institute Cell line
Xylene SINOPHARM 10023418 Dewaxing
Y-27632 2HCL Selleckchem S1049 ROCK-inhibitor

References

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Li, W., Li, H., Yan, H., Gao, L., Wang, X., Zhao, L., Yan, Y., Ye, Z., Xi, J., Yue, W., Li, Z. Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (202), e66246, doi:10.3791/66246 (2023).

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