Summary

Генерация нейронной сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека

Published: December 22, 2023
doi:

Summary

В настоящем протоколе описывается оптимизированная 3D-система индукции нейронной сетчатки, которая снижает адгезию и слияние органоидов сетчатки с высокой повторяемостью и эффективностью.

Abstract

Ретинопатия является одной из основных причин слепоты во всем мире. Исследование ее патогенеза имеет важное значение для ранней диагностики и своевременного лечения ретинопатии. К сожалению, этические барьеры препятствуют сбору доказательств от людей. Недавние многочисленные исследования показали, что плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) могут быть дифференцированы в органоиды сетчатки (РО) с использованием различных протоколов индукции, которые имеют огромный потенциал в ретинопатии для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и терапии на основе стволовых клеток. В этом исследовании описывается оптимизированный протокол индукции для генерации нейронной сетчатки (NR), который значительно снижает вероятность везикуляции и слияния, увеличивая вероятность успеха продукции до 60-го дня. Основываясь на способности ПСК к самореорганизации после диссоциации, в сочетании с определенными комплементарными факторами, этот новый метод может специфически стимулировать дифференцировку NR. Кроме того, этот подход является несложным, экономически эффективным, демонстрирует значительную повторяемость и эффективность, представляет обнадеживающие перспективы для персонализированных моделей заболеваний сетчатки и обеспечивает обильный резервуар клеток для таких применений, как клеточная терапия, скрининг лекарств и тестирование генной терапии.

Introduction

Глаз служит основным источником информации среди органов чувств человека, а сетчатка является основной зрительной сенсорной тканью в глазах млекопитающих1. Ретинопатия является одной из основных глобальных причин заболеваний глаз, приводящих к слепоте2. Около 2,85 миллиона человек во всем мире страдают от различных степеней нарушения зрения, вызванных ретинопатией3. Следовательно, изучение его патогенеза имеет решающее значение для ранней диагностики и своевременного лечения. Большинство исследований ретинопатии человека были в основном сосредоточены на животных моделях 4,5,6. Однако сетчатка человека представляет собой сложную, многослойную ткань, состоящую из различных типов клеток. Традиционные двумерные (2D) системы клеточных культур и животных моделей, как правило, не в состоянии точно воспроизвести нормальное пространственно-временное развитие и метаболизм лекарств в сетчатке естественного человека 7,8.

В последнее время технологии 3D-культивирования позволяют создавать тканеподобные органы из плюрипотентных стволовых клеток (ПСК)9,10. Органоиды сетчатки (РО), полученные из человеческих ПСК в системе 3D-суспензионных культур, не только содержат семь типов клеток сетчатки, но и демонстрируют отчетливую стратифицированную структуру, аналогичную сетчатке человека in vivo 11,12,13. ОО, полученные из ПСХ человека, завоевали популярность и широкую доступность и в настоящее время являются лучшими моделями in vitro для изучения развития и заболевания сетчатки человека14,15. За последние несколько десятилетий многочисленные исследователи продемонстрировали, что человеческие ПСК, включая эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), могут дифференцироваться в ОО с помощью различных протоколов индукции. Эти достижения обладают огромным потенциалом в ретинопатии для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и терапии на основе стволовых клеток 16,17,18.

Однако генерация нервной сетчатки (НР) из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК) является сложным, громоздким и трудоемким процессом. Кроме того, вариации тканевых органоидов от партии к партии могут привести к снижению воспроизводимости результатов19,20. Многочисленные внутренние и внешние факторы могут влиять на выход органоидов сетчатки (РО), такие как количество или виды исходных клеток и использование транскрипционных факторов и низкомолекулярных соединений 21,22,23. С тех пор, как в лаборатории Сасаи был создан первый человеческий ОО11, на протяжении многих лет было предложено множество модификаций для повышения простоты и эффективности процесса индукции 13,21,24,25. К сожалению, на сегодняшний день не установлено золотого стандарта для получения ПВ во всех лабораториях. Действительно, существует определенная степень расхождения в ОК в результате различных методов индукции, а также широкий разброс экспрессии маркеров сетчатки и надежности их структуры22,26. Эти проблемы могут серьезно осложнить сбор образцов и интерпретацию результатов исследования. Таким образом, необходим более консолидированный и надежный протокол дифференциации для достижения максимальной эффективности при минимальной гетерогенности генерации обратного осмоса.

В этом исследовании описывается оптимизированный протокол индукции, основанный на комбинации Kuwahara et al.12 и Döpper et al.27 с подробными инструкциями. Новый метод значительно снижает вероятность органоидной везикуляции и слияния, повышая успешность генерации НР. Эта разработка имеет большие перспективы для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и клеточной терапии при заболеваниях сетчатки.

Protocol

Данное исследование было проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено Комитетом по институциональной этике Китайской больницы общего профиля НОАК. Линейка ESC WA09 (H9) была получена от научно-исследовательского института WiCell. 1. Приготовлени…

Representative Results

Графический обзор модифицированного протокола показан на рисунке 1. H9-ESC использовались для генерации RO, когда клетки были выращены до плотности 70%-80%. Одноячеистые суспензии H9-ESC в 96 конических лунках с V-образным дном агрегировались в 1-й день и к 6-м суткам образовывали хо…

Discussion

Человеческие ОР могут пространственно и во времени повторять развитие сетчатки плода, а ранние ОР демонстрируют высокую степень сходства с сетчаткой плода на эквивалентных стадиях развития15. С точки зрения морфологии тканей и молекулярной экспрессии, человеческий обрат?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Никакой.

Materials

0.01 M TPBS Servicebio G0002 Washing slices
4% Paraformaldehyde Servicebio G1101-500ML Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette NEST Biotechnology 318516 Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells Sumitomo Bakelit MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides CITOTEST 188105 Fix slices
AggreWell medium STEMCELL Technologies 5893 Medium
Anhydrous ethanol SINOPHARM 10009218 Dehydrate 
Anti-CHX10 Santa Cruz sc-365519 Primary antibody
Antifade Solution ZSGB-BIO ZLI-9556
Anti-KI67 Abcam ab16667 Primary antibody
Anti-NESTIN Sigma N5413 Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) Beyotime AT809 Primary antibody
Anti-PAX6 Abcam ab195045 Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS) STEMCELL Technologies 7922 Cell dissociation
CHIR99021 Selleckchem S2924 GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate Gibco 12531018 250×
Citrate Antigen Retrieval Solution Servicebio G1202-250ML 20×, pH 6.0
CS10 STEMCELL Technologies 1001061 Cell Freezing Medium
DAPI Roche 10236276001 Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 11330032 Medium
DMEM/F12-GlutaMAX Gibco 10565018 Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 Invitrogen A32766 Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A10042 Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Biosharp BL518A 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM) Corning 354277 Coating plates
F12-Glutamax Gibco 31765035 Medium
Fetal Bovine Serum Gibco A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer TissueGnostics TissueFAXS Plus Scan sections
IMDM-GlutaMAX Gibco 31980030 Medium
IWR1-endo Selleckchem S7086 Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028
LDN-193189 2HCl Selleckchem S7507 BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates Corning 3473
Low-adhesion 6-well Plates Corning 3471
Maintenance medium (MM) STEMCELL Technologies 85850 Medium
N2 supplement Gibco 17502048
Normal Donkey Serum Solarbio SL050 Blocking buffer
Paraplast Leica 39601006 Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x) Gibco C10010500BT Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) R&D 314-BP Key protein factor
Retinoic acid Sigma R2625 Powder, keep out of light
SB431542 Selleckchem S1067 ALK5-inhibitor
SU5402 Selleckchem S7667 Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen ZSGB-BIO ZLI-9305
Taurine Sigma T0625-10G
Thioglycerol Sigma M1753
Triton X-100 Sigma X100 Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line WiCell Research Institute Cell line
Xylene SINOPHARM 10023418 Dewaxing
Y-27632 2HCL Selleckchem S1049 ROCK-inhibitor

References

  1. Hoon, M., Okawa, H., Della Santina, ., Wong, L., O, R. Functional architecture of the retina: development and disease. Prog Retin Eye Res. 42, 44-84 (2014).
  2. Steinmetz, J. D., et al. Causes of blindness and vision impairment in 2020 and trends over 30 years, and prevalence of avoidable blindness in relation to VISION 2020: the Right to Sight: an analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet Glob Health. 9 (2), e144-e160 (2021).
  3. Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. 96 (5), 614-618 (2012).
  4. Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (40), e9391-e9400 (2018).
  5. Slijkerman, R. W., et al. The pros and cons of vertebrate animal models for functional and therapeutic research on inherited retinal dystrophies. Prog Retin Eye Res. 48, 137-159 (2015).
  6. Peng, Y. R., et al. Molecular classification and comparative taxonomics of foveal and peripheral cells in primate retina. Cell. 176 (5), 1222-1237 (2019).
  7. Ribeiro, J., et al. Restoration of visual function in advanced disease after transplantation of purified human pluripotent stem cell-derived cone photoreceptors. Cell Rep. 35 (3), 109022 (2021).
  8. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  9. Manafi, N., et al. Organoids and organ chips in ophthalmology. Ocul Surf. 19, 1-15 (2021).
  10. Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nat Rev Genet. 19 (11), 671-687 (2018).
  11. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation`of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nat Commun. 6, 6286 (2015).
  13. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nat Commun. 5, 4047 (2014).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. Retinal organoids: a window into human retinal development. Development. 147 (24), (2020).
  16. Li, H., et al. Protective effects of resveratrol on the ethanol-induced disruption of retinogenesis in pluripotent stem cell-derived organoids. FEBS Open Bio. 13 (5), 845-866 (2023).
  17. Zou, T., et al. Organoid-derived C-Kit(+)/SSEA4(-) human retinal progenitor cells promote a protective retinal microenvironment during transplantation in rodents. Nat Commun. 10 (1), 1205 (2019).
  18. Mandai, M. Pluripotent stem cell-derived Retinal organoid/cells for retinal regeneration therapies: A review. Regen Ther. 22, 59-67 (2023).
  19. Suarez-Martinez, E., Suazo-Sanchez, I., Celis-Romero, M., Carnero, A. 3D and organoid culture in research: physiology, hereditary genetic diseases and cancer. Cell Biosci. 12 (1), 39 (2022).
  20. Bose, R., Banerjee, S., Dunbar, G. L. Modeling neurological disorders in 3D organoids using human-derived pluripotent stem cells. Front Cell Dev Biol. 9, 640212 (2021).
  21. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human Retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  22. Sanjurjo-Soriano, C., et al. RA delays initial photoreceptor differentiation and results in a highly structured mature Retinal organoid. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 478 (2022).
  23. Li, X., Zhang, L., Tang, F., Wei, X. Retinal organoids: cultivation, differentiation, and transplantation. Front Cell Neurosci. 15, 638439 (2021).
  24. Zerti, D., et al. Developing a simple method to enhance the generation of cone and rod photoreceptors in pluripotent stem cell-derived Retinal organoids. Stem Cells. 38 (1), 45-51 (2020).
  25. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human Retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  26. Yamasaki, S., et al. Addition of Chk1 inhibitor and BMP4 cooperatively promotes retinal tissue formation in self-organizing human pluripotent stem cell differentiation culture. Regen Ther. 19, 24-34 (2022).
  27. Döpper, H., et al. Differentiation protocol for 3D Retinal organoids, immunostaining and signal quantitation. Curr Protoc Stem Cell Biol. 55 (1), e120 (2020).
  28. Norrie, J. L., et al. Retinoblastoma from human stem cell-derived Retinal organoids. Nat Commun. 12 (1), 4535 (2021).

Play Video

Cite This Article
Li, W., Li, H., Yan, H., Gao, L., Wang, X., Zhao, L., Yan, Y., Ye, Z., Xi, J., Yue, W., Li, Z. Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (202), e66246, doi:10.3791/66246 (2023).

View Video