Summary

Generazione di retina neurale da cellule staminali pluripotenti umane

Published: December 22, 2023
doi:

Summary

Il presente protocollo descrive un sistema di induzione retinica neurale 3D ottimizzato che riduce l’adesione e la fusione degli organoidi retinici con elevata ripetibilità ed efficienza.

Abstract

La retinopatia è una delle principali cause di cecità in tutto il mondo. Indagare la sua patogenesi è essenziale per la diagnosi precoce e il trattamento tempestivo della retinopatia. Sfortunatamente, le barriere etiche ostacolano la raccolta di prove da parte degli esseri umani. Recentemente, numerosi studi hanno dimostrato che le cellule staminali pluripotenti umane (PSC) possono essere differenziate in organoidi retinici (RO) utilizzando diversi protocolli di induzione, che hanno un enorme potenziale nella retinopatia per la modellazione della malattia, lo screening dei farmaci e le terapie basate sulle cellule staminali. Questo studio descrive un protocollo di induzione ottimizzato per generare la retina neurale (NR) che riduce significativamente la probabilità di vescicolazione e fusione, aumentando il tasso di successo della produzione fino al giorno 60. Basato sulla capacità delle PSC di auto-riorganizzarsi dopo la dissociazione, combinata con alcuni fattori complementari, questo nuovo metodo può guidare in modo specifico la differenziazione delle NR. Inoltre, l’approccio è semplice, conveniente, mostra una notevole ripetibilità ed efficienza, presenta prospettive incoraggianti per modelli personalizzati di malattie retiniche e fornisce un abbondante serbatoio cellulare per applicazioni come la terapia cellulare, lo screening farmacologico e i test di terapia genica.

Introduction

L’occhio funge da fonte primaria di informazioni tra gli organi sensoriali umani, con la retina che è il principale tessuto sensoriale visivo negli occhi dei mammiferi1. La retinopatia è una delle principali cause globali di malattie oculari, che porta alla cecità2. Circa 2,85 milioni di persone in tutto il mondo soffrono di vari gradi di disabilità visiva a causa della retinopatia3. Di conseguenza, indagare la sua patogenesi è fondamentale per una diagnosi precoce e un trattamento tempestivo. La maggior parte degli studi sulla retinopatia umana si è concentrata principalmente su modelli animali 4,5,6. Tuttavia, la retina umana è un tessuto complesso e multistrato che comprende vari tipi di cellule. I tradizionali sistemi di coltura cellulare bidimensionale (2D) e i sistemi di modelli animali in genere non riescono a ricapitolare fedelmente il normale sviluppo spazio-temporale e il metabolismo farmacologico della retina umana nativa 7,8.

Recentemente, le tecniche di coltura 3D si sono evolute per generare organi simili ai tessuti da cellule staminali pluripotenti (PSCs)9,10. Gli organoidi retinici (RO) generati da PSC umane in un sistema di coltura in sospensione 3D non solo contengono sette tipi di cellule retiniche, ma mostrano anche una struttura stratificata distinta simile alla retina umana in vivo 11,12,13. Gli RO umani derivati da PSC hanno guadagnato popolarità e ampia disponibilità e sono attualmente i migliori modelli in vitro per lo studio dello sviluppo e della malattia della retina umana14,15. Negli ultimi decenni, numerosi ricercatori hanno dimostrato che le PSC umane, comprese le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), possono differenziarsi in RO utilizzando vari protocolli di induzione. Questi progressi hanno un enorme potenziale nella retinopatia per la modellazione della malattia, lo screening farmacologico e le terapie basate sulle cellule staminali 16,17,18.

Tuttavia, la generazione di retina neurale (NR) da cellule staminali pluripotenti umane (PSC) è un processo complesso, ingombrante e dispendioso in termini di tempo. Inoltre, le variazioni da lotto a lotto negli organoidi tissutali possono portare a una minore riproducibilità dei risultati19,20. Numerosi fattori intrinseci ed estrinseci possono influenzare la resa degli organoidi retinici (RO), come il numero o la specie di cellule di partenza e l’uso di fattori di trascrizione e composti a piccole molecole 21,22,23. Da quando il primo RO umano è stato generato dal laboratorio Sasai11, nel corso degli anni sono state proposte molteplici modifiche per migliorare la facilità e l’efficacia del processo di induzione 13,21,24,25. Purtroppo, ad oggi, non è stato stabilito alcun protocollo gold standard per la generazione di RO in tutti i laboratori. In effetti, c’è un certo grado di discrepanza negli RO risultanti da diversi metodi di induzione, così come un’ampia variazione nell’espressione dei marcatori retinici e nella robustezza della loro struttura22,26. Questi problemi possono complicare gravemente la raccolta dei campioni e l’interpretazione dei risultati dello studio. Pertanto, è necessario un protocollo di differenziamento più consolidato e robusto per massimizzare l’efficienza con una minima eterogeneità di generazione di RO.

Questo studio descrive un protocollo di induzione ottimizzato basato su una combinazione di Kuwahara et al.12 e Döpper et al.27 con istruzioni dettagliate. Il nuovo metodo riduce significativamente la probabilità di vescicolazione e fusione degli organoidi, aumentando il tasso di successo della generazione di NR. Questo sviluppo è molto promettente per la modellazione delle malattie, lo screening dei farmaci e le applicazioni di terapia cellulare per i disturbi della retina.

Protocol

Questo studio è stato condotto in conformità con i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvato dal Comitato Etico Istituzionale dell’Ospedale Generale Cinese del PLA. La linea ESC WA09 (H9) è stata ottenuta dall’Istituto di Ricerca WiCell. 1. Terreni di coltura e preparazione dei reagenti Terreno di coltura ESC umano e soluzione di passaggioTerreno di mantenimento (MM): Preparare 500 mL di MM completo (terreno basale + supplemento 5x; vedere <stro…

Representative Results

Una panoramica grafica del protocollo modificato è mostrata nella Figura 1. Le H9-ESC sono state utilizzate per generare RO quando le cellule sono state cresciute fino a una densità del 70%-80%. Sospensioni a cella singola di H9-ESC in 96 pozzetti conici con fondo a V si sono aggregate il giorno 1 e hanno formato EB rotondi ben circoscritti entro il giorno 6. Con l’aumentare del tempo di coltura, il volume degli EB è aumentato gradualmente. Il giorno 30, le strutture simili a neuroepiteli…

Discussion

Gli RO umani possono ricapitolare spazialmente e temporalmente lo sviluppo della retina fetale e i RO precoci mostrano un alto grado di somiglianza con la retina fetale a stadi equivalenti di sviluppo15. In termini di morfologia tissutale ed espressione molecolare, l’RO umana rispecchia da vicino l’effettivo stato di crescita del tessuto retinico, offrendo opportunità straordinarie e senza precedenti nei campi della modellazione delle malattie, dello screening dei farmaci e della medicina rigener…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nessuno.

Materials

0.01 M TPBS Servicebio G0002 Washing slices
4% Paraformaldehyde Servicebio G1101-500ML Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette NEST Biotechnology 318516 Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells Sumitomo Bakelit MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides CITOTEST 188105 Fix slices
AggreWell medium STEMCELL Technologies 5893 Medium
Anhydrous ethanol SINOPHARM 10009218 Dehydrate 
Anti-CHX10 Santa Cruz sc-365519 Primary antibody
Antifade Solution ZSGB-BIO ZLI-9556
Anti-KI67 Abcam ab16667 Primary antibody
Anti-NESTIN Sigma N5413 Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) Beyotime AT809 Primary antibody
Anti-PAX6 Abcam ab195045 Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS) STEMCELL Technologies 7922 Cell dissociation
CHIR99021 Selleckchem S2924 GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate Gibco 12531018 250×
Citrate Antigen Retrieval Solution Servicebio G1202-250ML 20×, pH 6.0
CS10 STEMCELL Technologies 1001061 Cell Freezing Medium
DAPI Roche 10236276001 Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO) Sigma D2650
DMEM/F12 Gibco 11330032 Medium
DMEM/F12-GlutaMAX Gibco 10565018 Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 Invitrogen A32766 Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A10042 Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) Biosharp BL518A 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM) Corning 354277 Coating plates
F12-Glutamax Gibco 31765035 Medium
Fetal Bovine Serum Gibco A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer TissueGnostics TissueFAXS Plus Scan sections
IMDM-GlutaMAX Gibco 31980030 Medium
IWR1-endo Selleckchem S7086 Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement Gibco 10828028
LDN-193189 2HCl Selleckchem S7507 BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates Corning 3473
Low-adhesion 6-well Plates Corning 3471
Maintenance medium (MM) STEMCELL Technologies 85850 Medium
N2 supplement Gibco 17502048
Normal Donkey Serum Solarbio SL050 Blocking buffer
Paraplast Leica 39601006 Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x) Gibco C10010500BT Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) R&D 314-BP Key protein factor
Retinoic acid Sigma R2625 Powder, keep out of light
SB431542 Selleckchem S1067 ALK5-inhibitor
SU5402 Selleckchem S7667 Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen ZSGB-BIO ZLI-9305
Taurine Sigma T0625-10G
Thioglycerol Sigma M1753
Triton X-100 Sigma X100 Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line WiCell Research Institute Cell line
Xylene SINOPHARM 10023418 Dewaxing
Y-27632 2HCL Selleckchem S1049 ROCK-inhibitor

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Li, W., Li, H., Yan, H., Gao, L., Wang, X., Zhao, L., Yan, Y., Ye, Z., Xi, J., Yue, W., Li, Z. Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (202), e66246, doi:10.3791/66246 (2023).

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