使用荧光 cAMP 原位差检测器在活细胞中实时 cAMP 动力学
Summary
本研究中提出的协议说明了cAMP原位差动检测器通过两种方法测量cAMP的有效性。一种方法使用带有 HEK-293 细胞的 96 孔板读数分光光度计。另一种方法在荧光显微镜下展示单个HASM细胞。
Abstract
cAMP原 位 差异检测器（cADDis）是一种新型生物传感器，可以连续测量活细胞中的cAMP水平。该生物传感器由与Epac2的铰链区域相连的环状置换荧光蛋白制成。这创建了一个单一的荧光团生物传感器，在结合 cAMP 时显示荧光增加或减少。生物传感器有红色和绿色的向上版本，以及绿色的向下版本，以及针对亚细胞位置的几种红色和绿色版本。为了说明生物传感器的有效性，使用了绿色的向下版本，该版本在cAMP结合时荧光减少。演示了使用该传感器的两种方案：一种利用与高通量筛选兼容的 96 孔板读取分光光度计，另一种利用荧光显微镜上的单细胞成像。在酶标仪上，用 10 μM 毛喉素或 10 nM 异丙肾上腺素刺激在 96 孔板中培养的 HEK-293 细胞，其诱导绿色向下版本的荧光快速且大幅减少。该生物传感器用于测量在荧光显微镜下监测的单个人体气道平滑肌 （HASM） 细胞中的 cAMP 水平。当用毛喉素或异丙肾上腺素刺激时，绿色向下的生物传感器对细胞群表现出类似的反应。这种单细胞测定允许在 20 倍和 40 倍放大下可视化生物传感器的位置。因此，这种 cAMP 生物传感器具有灵敏和灵活性，可以实时测量永生化细胞和原代细胞中的 cAMP，以及单细胞或细胞群的 cAMP。这些特性使cADD成为研究活细胞中cAMP信号动力学的宝贵工具。
Introduction
腺苷 3′，5′-环磷酸 （cAMP） 在细胞通讯和各种生理过程的协调中起着核心作用。cAMP 充当第二信使，传递来自激素、神经递质或其他细胞外分子的外部信号，以启动细胞内事件的级联反应1。此外，cAMP 错综复杂地参与各种信号通路，包括与 G 蛋白偶联受体 （GPCR） 和腺苷酸环化酶相关的信号通路。了解 cAMP 在细胞信号转导中的作用对于揭示正常细胞功能背后的复杂机制和开发针对各种疾病的潜在疗法至关重要2.
过去，已经采用各种方法直接或间接地测量 cAMP。这些包括细胞 ATP 池的放射性标记，然后进行色谱柱纯化、HPLC、放射免疫测定和酶联免疫测定 1,2。这些传统检测方法受到限制，因为它们是终点测量，需要大量样本来构建时间依赖性响应。最近，荧光共振能量转移 （FRET） 传感器被开发出来，用于在活细胞中创建检测，产生实时、动态的数据，并允许传感器在不同的亚细胞位置进行靶向3。FRET利用两个荧光团，一个荧光供体和一个荧光受体，当靠近时，受体荧光团将被供体荧光输出激发。最常用的两种荧光基团是青色荧光蛋白 （CFP） 和黄色荧光蛋白 （YFP），因为它们具有相容的激发和发射特性。除CFP和YFP外，绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）的利用也常用于FRET生物传感器。cAMP FRET生物传感器通过在Epac2 cAMP结合蛋白的两端具有供体和受体来操作。cAMP 结合改变了 Epac 的确认，并增加了供体和受体荧光基团之间的距离 3,4。这种构象变化是通过FRET的损失来检测的，即受体荧光团通过从供体荧光团液滴转移的能量激发3。虽然这是一个看似简单的过程，但用于 cAMP 研究的 FRET 生物传感器存在大量限制和问题5.其中之一是荧光蛋白的选择，例如GFP，它可以自然二聚化，从而降低灵敏度6。基于 FRET 的 cAMP 生物传感器已靶向特定微结构域7，但由于具有两个荧光基团的构建体尺寸大，可能存在局限性6。另一个重要问题是，由于荧光团的激发和发射之间的重叠，导致FRET信号的信噪比低，导致采样频率高，结果分析复杂化4,5。
最近，新型生物传感器（cAMP Difference Detector In Situ）cADDis 在研究 cAMP 信号传导的调节时解决了这些和其他限制8。一个重要的改进是对单一荧光基团的依赖性。这样可以获得快速高效的信号，具有更宽的动态范围和高信噪比。因此，可以有更高的准确性，因为要梳理的波长范围较小8.与FRET探针一样，该生物传感器已靶向亚细胞位置，从而可以研究脂质筏和非筏以及其他亚细胞结构域中的分隔理论和探索9。也许最重要的是单一荧光团生物传感器适用于高通量筛选，与基于 FRET 的生物传感器相比，它提高了灵敏度和可重复性。该生物传感器被封装到 BacMam 载体中，便于转导多种细胞类型并精确控制蛋白质表达。
通过 BacMam 载体进行表达控制在使用来自不同物种的 GPCR 直系同源物的测定中特别有用，以促进动物研究数据的解释。此外，控制受体表达对于测量不同程度的药物疗效（例如，反向激动剂和部分激动剂）至关重要，而低水平的受体表达有助于模拟动物组织中发现的低水平。BacMam 是一种杆状病毒载体，已被修饰以转导哺乳动物细胞，例如原代细胞培养物和 HEK-293 系10。显性可选标记物使 BacMam 比传统质粒感染具有更高的稳定性11。这种选择性启动子允许更有效的基因递送和表达。此外，添加曲古抑菌素 A（一种组蛋白脱乙酰酶抑制剂）可增强报告蛋白水平11。表达水平可以通过所用 BacMam 病毒的滴度来控制，并且应针对每种细胞类型进行优化。在这种生物传感器的情况下，红色或绿色荧光蛋白与N端和C端的Epac相连。当 cAMP 结合时，生物传感器的构象变化会移动与荧光蛋白相邻的氨基酸。这种位移使吸光度从阴离子态移动到400nm处的中性态，从而降低了荧光。
在单个细胞中有 90-120 个 GPCR 表达，对多种神经体液信号有反应12。因此，可以假设每个细胞至少有几十个GPCRs可以分别通过Gs或Gi偶联刺激或抑制cAMP。虽然在实时监测第二个信使（例如FRET）方面取得了进展，但需要更有效的方法。本文介绍了使用cADDis实时监测cAMP信号合成和降解的方法。可以使用荧光酶标仪进行高通量检测或使用荧光显微镜进行单细胞检测，实时监测荧光的变化。这些方法对于 通过 cAMP进行GPCR信号转导的广泛生物学问题非常有用。
Protocol
Representative Results
Discussion
准确、灵敏地测量 cAMP 对于了解其在各种细胞过程中的作用以及研究 cAMP 依赖性信号通路的活性至关重要。通常采用几种方法测量 cAMP 水平，包括 ELISA、放射免疫测定、FRET 生物传感器和 GloSensor cAMP 测定 14,15,16,17,18。每种 cAMP 检测都有其优点和缺点。该协议允许实时检测和?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了美国国家心肺血液研究所 （NHLBI） （HL169522） 的支持。
Materials
| 96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| 35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
| 96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
| BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
| Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
| Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
| DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
| DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
| Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
| Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
| Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
| Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
| RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
| Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
| Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
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