Динамика цАМФ в реальном времени в живых клетках с использованием флуоресцентного дифференциального детектора цАМФ in situ
Summary
Протокол, представленный в этом исследовании, иллюстрирует эффективность дифференциального детектора цАМФ in situ в измерении цАМФ с помощью двух методов. В одном из методов используется 96-луночный планшетный спектрофотометр с ячейками HEK-293. Другой метод демонстрирует отдельные клетки HASM под флуоресцентным микроскопом.
Abstract
cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) — это новый биосенсор, который позволяет непрерывно измерять уровни цАМФ в живых клетках. Биосенсор создается из циркулярно переставленного флуоресцентного белка, связанного с шарнирной областью Epac2. В результате создается один флуорофорный биосенсор, который демонстрирует либо повышенную, либо пониженную флуоресценцию при связывании цАМФ. Биосенсор существует в красной и зеленой версиях вверх, а также в зеленой версии вниз, а также в нескольких красных и зеленых версиях, предназначенных для субклеточных мест. Чтобы проиллюстрировать эффективность биосенсора, была использована зеленая версия вниз, которая снижает флуоресценцию при связывании с цАМФ. Продемонстрированы два протокола с использованием этого датчика: один с использованием 96-луночного спектрофотометра, совместимого с высокопроизводительным скринингом, а другой с использованием визуализации одиночных клеток на флуоресцентном микроскопе. На планшете клетки HEK-293, культивируемые в 96-луночных планшетах, стимулировали 10 мкМ форсколином или 10 нМ изопротеренолом, что вызывало быстрое и значительное снижение флуоресценции в зеленом нисходящем варианте. Биосенсор был использован для измерения уровней цАМФ в отдельных клетках гладких мышц дыхательных путей человека (HASM), контролируемых под флуоресцентным микроскопом. Зеленый направленный вниз биосенсор показал аналогичную реакцию на популяции клеток при стимуляции форсколином или изопротеренолом. Этот анализ одиночных клеток позволяет визуализировать местоположение биосенсора при 20-кратном и 40-кратном увеличении. Таким образом, этот биосенсор цАМФ является чувствительным и гибким, что позволяет измерять цАМФ в режиме реального времени как в иммортализированных и первичных клетках, так и в отдельных клетках или популяциях клеток. Эти характеристики делают cADDs ценным инструментом для изучения динамики передачи сигналов цАМФ в живых клетках.
Introduction
Аденозин-3′,5′-циклический монофосфат, цАМФ, играет центральную роль в клеточной коммуникации и координации различных физиологических процессов. цАМФ действует как второй посредник, ретранслируя внешние сигналы от гормонов, нейротрансмиттеров или других внеклеточных молекул, чтобы инициировать каскад внутриклеточных событий1. Кроме того, цАМФ неразрывно связан с различными сигнальными путями, в том числе связанными с рецепторами, связанными с G-белком (GPCR) и аденилатциклазами. Понимание роли цАМФ в передаче клеточной сигнализации имеет основополагающее значение для разгадки сложных механизмов, лежащих в основе нормальных клеточных функций, и разработки потенциальных методов лечения широкого спектразаболеваний.
В прошлом для прямого или косвенного измерения цАМФ использовались различные методы. Они включали радиоактивное мечение клеточных пулов АТФ с последующей очисткой колонки, ВЭЖХ, радиоиммунными анализами и иммуноферментными анализами 1,2. Эти устаревшие анализы ограничены тем фактом, что они являются конечными измерениями, требующими большого количества образцов для построения зависимых от времени ответов. Совсем недавно были разработаны датчики флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) для создания анализов в живых клетках, производящих динамические данные в режиме реального времени и позволяющих нацеливаться на датчики в различных субклеточных местоположениях. FRET использует два флуорофора, один флуоресцентный донор и один флуоресцентный акцептор, которые при нахождении в непосредственной близости от акцептора флуорофора будут возбуждаться донорским флуоресцентным выходом. Двумя наиболее часто используемыми флуорофорами являются голубой флуоресцентный белок (CFP) и желтый флуоресцентный белок (YFP), поскольку они обладают совместимыми свойствами возбуждения и излучения. В дополнение к CFP и YFP, использование зеленого флуоресцентного белка (GFP) и красного флуоресцентного белка (RFP) обычно используется для биосенсоров FRET. Биосенсоры cAMP FRET работают за счет наличия донора и акцептора на противоположных концах связывающего белка Epac2 cAMP. Связывание цАМФ изменяет подтверждение Epac и увеличивает расстояние между донором и акцепторными флуорофорами 3,4. Это конформационное изменение обнаруживается потерей FRET, то есть возбуждением акцепторного флуорофора энергией, передаваемойот капель донорного флуорофора3. Несмотря на кажущуюся простоту процесса, существует множество ограничений и проблем с биосенсором FRET для исследований цАМФ5. Одним из них является отбор флуоресцентных белков, например, GFP, которые могут димеризоваться естественным образом, снижая таким образом чувствительность6. Биосенсоры cAMP на основе FRET были нацелены на конкретные микродомены7, но могут быть ограничения из-за большого размера конструкции с двумя флуорофорами6. Другой существенной проблемой является низкое отношение сигнал/шум сигналов FRET в результате перекрытия между возбуждением и излучением флуорофора, что приводит к высокой частоте дискретизации и усложнению анализа результатов 4,5.
Совсем недавно новый биосенсор (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis решил эти и другие ограничения, когда дело доходит до изучения регуляции передачи сигналов cAMP8. Одним из важных улучшений является зависимость от одного флуорофора. Это обеспечивает быстрый и эффективный сигнал с более широким динамическим диапазоном и высоким соотношением сигнал/шум. В результате может быть больше точности, так как существует менее широкий диапазон длин волн для прочесывания8. Как и FRET-зонды, биосенсор был нацелен на субклеточные места, что позволяет проводить исследования в области теории компартментации и исследовать липидные рафты и не-рафты, а также другие субклеточныедомены. Возможно, наиболее важным является пригодность одного флуорофорного биосенсора для высокопроизводительного скрининга, который имеет улучшенную чувствительность и воспроизводимость по сравнению с биосенсорами на основе FRET. Биосенсор упакован в вектор BacMam, что обеспечивает легкую трансдукцию широкого спектра типов клеток и точный контроль экспрессии белков.
Контроль экспрессии с помощью вектора BacMam может быть особенно полезен при анализах с использованием ортологов GPCR различных видов для облегчения интерпретации данных исследований на животных. Кроме того, контроль над экспрессией рецепторов имеет решающее значение для измерения различных степеней эффективности лекарств (например, обратных агонистов и частичных агонистов), а низкие уровни экспрессии рецепторов полезны для имитации низких уровней, обнаруженных в тканях животных. BacMam представляет собой бакуловирусный вектор, который был модифицирован для трансдукции клеток млекопитающих, таких как первичные клеточные культуры и линии HEK-29310. Доминирующие селективные маркеры позволяют BacMam обеспечивать большую стабильность по сравнению с традиционными плазмидными инфекциями11. Такие селективные промоторы обеспечивают более эффективную доставку и экспрессию генов. Кроме того, добавление трихостатина А (ингибитора гистондеацетилазы) повышает уровень репортерного белка11. Уровни экспрессии можно контролировать с помощью титра используемого вируса BacMam, и они должны быть оптимизированы для каждого типа клеток. В случае этого биосенсора красный или зеленый флуоресцентный белок связан с Epac на N- и C-концах. Когда цАМФ связывается, конформационное изменение в биосенсоре перемещает аминокислоты, прилегающие к флуоресцентному белку. Такой сдвиг перемещает поглощение из анионного состояния в нейтральное состояние с длиной волны 400 нм, тем самым уменьшая флуоресценцию.
В одной клетке экспрессируется 90-120 GPCR, которые реагируют на широкий спектр нейрогуморальных сигналов12. Таким образом, можно предположить, что по крайней мере несколько десятков GPCR на клетку могут стимулировать или ингибировать цАМФ через Gs или Gi-связь соответственно. Несмотря на то, что был достигнут прогресс в мониторинге этого второго мессенджера в режиме реального времени, такого как FRET, необходимы более эффективные методы. Представлена методология мониторинга синтеза и деградации сигналов cAMP с помощью cADDis в режиме реального времени. Изменение флуоресценции можно контролировать в режиме реального времени с помощью считывателя флуоресцентных планшетов для высокопроизводительных анализов или с помощью флуоресцентного микроскопа для анализа отдельных клеток. Эти методы полезны для решения широкого круга биологических вопросов, касающихся передачи сигналов GPCR через цАМФ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Точное и чувствительное измерение цАМФ имеет решающее значение для понимания его роли в различных клеточных процессах и для изучения активности цАМФ-зависимых сигнальных путей. Существует несколько методов, обычно используемых для измерения уровня цАМФ, включая ИФА, радиоиммунный ан…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальным институтом сердца, легких и крови (NHLBI) (HL169522).
Materials
| 96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| 35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
| 96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
| BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
| Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
| Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
| DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
| DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
| Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
| Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
| Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
| Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
| RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
| Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
| Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
References
- Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
- Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity. Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).
- Li, I. T., Pham, E., Truong, K. Protein biosensors based on the principle of fluorescence resonance energy transfer for monitoring cellular dynamics. Biotechnol Lett. 28 (24), 1971-1982 (2006).
- Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret. Cell Signal. 75, 109769 (2020).
- Leavesley, S. J., Rich, T. C. Overcoming limitations of fret measurements. Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).
- Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
- Agarwal, S. R., et al. Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes. Front Pharmacol. 9, 332 (2018).
- Tewson, P. H., Martinka, S., Shaner, N. C., Hughes, T. E., Quinn, A. M. New dag and cAMP sensors optimized for live-cell assays in automated laboratories. J Biomol Screen. 21 (3), 298-305 (2016).
- Tewson, P., et al. Assay for detecting Galphai-mediated decreases in cAMP in living cells. SLAS Discov. 23 (9), 898-906 (2018).
- Nunez, F. J., et al. Glucocorticoids rapidly activate cAMP production via g(alphas) to initiate non-genomic signaling that contributes to one-third of their canonical genomic effects. FASEB J. 34 (2), 2882-2895 (2020).
- Condreay, J. P., Witherspoon, S. M., Clay, W. C., Kost, T. A. Transient and stable gene expression in mammalian cells transduced with a recombinant baculovirus vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (1), 127-132 (1999).
- Insel, P. A., et al. G protein-coupled receptor (GPCR) expression in native cells: "Novel" endogpcrs as physiologic regulators and therapeutic targets. Mol Pharmacol. 88 (1), 181-187 (2015).
- Nunez, F. J., et al. Agonist-specific desensitization of PGE(2)-stimulated cAMP signaling due to upregulated phosphodiesterase expression in human lung fibroblasts. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 393 (2), 843-856 (2020).
- Ojiaku, C. A., et al. Transforming growth factor-beta1 decreases beta(2)-agonist-induced relaxation in human airway smooth muscle. Am J Respir Cell Mol Biol. 61 (2), 209-218 (2019).
- Zuo, H., et al. Cigarette smoke up-regulates pde3 and pde4 to decrease cAMP in airway cells. Br J Pharmacol. 175 (14), 2988-3006 (2018).
- Cullum, S. A., Veprintsev, D. B., Hill, S. J. Kinetic analysis of endogenous beta(2) -adrenoceptor-mediated cAMP glosensor responses in hek293 cells. Br J Pharmacol. 180 (2), 1304-1315 (2023).
- Liu, X., Sun, S. Q., Ostrom, R. S. Fibrotic lung fibroblasts show blunted inhibition by cAMP due to deficient cAMP response element-binding protein phosphorylation. J Pharmacol Exp Ther. 315 (2), 678-687 (2005).
- Bogard, A. S., Birg, A. V., Ostrom, R. S. Non-raft adenylyl cyclase 2 defines a cAMP signaling compartment that selectively regulates il-6 expression in airway smooth muscle cells: Differential regulation of gene expression by ac isoforms. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 387 (4), 329-339 (2014).
- Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases. Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).
- Ostrom, K. F., et al. Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms. Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).
- Auld, D. S., et al. Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity. J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).
- De Logu, F., et al. Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice. Nat Commun. 13 (1), 646 (2022).
- Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine. Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).
- Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption. Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).
- Zhang, S. X., et al. Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling. Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).
- Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning. Cell Rep. 38 (4), 110297 (2022).
- Zhang, C., et al. Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors. Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).
