蛍光cAMP差検出器In Situを用いた生細胞のリアルタイムcAMPダイナミクス
Summary
この研究で提示されたプロトコルは、2つの方法によるcAMPの測定におけるcAMP差分検出器 In Situ の有効性を示しています。1つの方法は、HEK-293セルを備えた96ウェルプレート読み取り分光光度計を利用します。もう1つの方法は、蛍光顕微鏡下で個々のHASM細胞を実証する方法です。
Abstract
cAMP Difference Detector In Situ (cADDis)は、生細胞内のcAMPレベルを連続的に測定できる新しいバイオセンサーです。バイオセンサーは、Epac2のヒンジ領域に結合した環状に置換された蛍光タンパク質から作成されます。これにより、cAMPの結合時に蛍光の増加または減少を示す単一の蛍光色素バイオセンサーが作成されます。バイオセンサーには、赤と緑の上向きバージョン、緑の下向きバージョン、および細胞内位置を対象としたいくつかの赤と緑のバージョンがあります。バイオセンサーの有効性を説明するために、cAMP結合時に蛍光が減少する緑色の下向きバージョンを使用しました。このセンサーを使用した2つのプロトコルが実演されています:1つはハイスループットスクリーニングと互換性のある96ウェルプレート読み取り分光光度計を利用し、もう1つは蛍光顕微鏡でのシングルセルイメージングを利用します。プレートリーダー上で、96ウェルプレートで培養したHEK-293細胞を10 μMフォルスコリンまたは10 nMイソプロテレノールで刺激したところ、緑色下向きバージョンで蛍光が急速かつ大幅に減少しました。バイオセンサーは、蛍光顕微鏡でモニターされた個々のヒト気道平滑筋(HASM)細胞のcAMPレベルを測定するために使用されました。緑色の下向きのバイオセンサーは、フォルスコリンまたはイソプロテレノールで刺激されたときに、細胞の集団に対して同様の応答を示しました。このシングルセルアッセイでは、バイオセンサーの位置を20倍および40倍の倍率で可視化することができます。したがって、このcAMPバイオセンサーは高感度で柔軟性があり、不死化細胞と初代細胞の両方、および単一細胞または細胞集団のcAMPをリアルタイムで測定できます。これらの特性により、cADDisは生細胞におけるcAMPシグナル伝達ダイナミクスを研究するための貴重なツールとなっています。
Introduction
アデノシン3′,5′-環状一リン酸(cAMP)は、細胞のコミュニケーションとさまざまな生理学的プロセスの調整において中心的な役割を果たします。cAMPはセカンドメッセンジャーとして機能し、ホルモン、神経伝達物質、またはその他の細胞外分子からの外部シグナルを中継して、細胞内イベントのカスケードを開始します1。さらに、cAMPは、Gタンパク質共役受容体(GPCR)やアデニリルシクラーゼに関連する経路など、さまざまなシグナル伝達経路に複雑に関与しています。細胞シグナル伝達におけるcAMPの役割を理解することは、正常な細胞機能の根底にある複雑なメカニズムを解明し、さまざまな病状に対する潜在的な治療法を開発するための基本です2。
これまで、cAMPを直接的または間接的に測定するために、さまざまな方法が採用されてきました。これらには、細胞ATPプールの放射性標識とそれに続くカラム精製、HPLC、ラジオイムノアッセイ、および酵素結合イムノアッセイが含まれていました1,2。これらのレガシーアッセイは、エンドポイントの測定値であり、時間依存の応答を構築するために多数のサンプルが必要であるという事実によって制限されています。最近では、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)センサーが開発され、生細胞でのアッセイを作成し、リアルタイムの動的データを生成し、センサーをさまざまな細胞内位置で標的にすることを可能にしました3。FRETは、2つの蛍光色素分子、1つの蛍光ドナー、および1つの蛍光受容体を活用し、近接すると、受容体蛍光色素分子はドナーの蛍光出力によって励起されます。最も使用される2つの蛍光色素は、シアン蛍光タンパク質(CFP)と黄色蛍光タンパク質(YFP)で、これらは励起特性と発光特性が適合するためです。FRETバイオセンサーには、CFPやYFPに加えて、緑色蛍光タンパク質(GFP)や赤色蛍光タンパク質(RFP)の利用が一般的に使用されています。cAMP FRETバイオセンサーは、Epac2 cAMP結合タンパク質の両端にドナーとアクセプターを持つことで動作します。cAMP結合は、Epacの確認を変化させ、ドナーとアクセプターの蛍光色素の間の距離を増加させます3,4。このコンフォメーション変化は、FRETの喪失、すなわち、ドナーフルオロフォア滴3から伝達されるエネルギーによるアクセプターフルオロフォアの興奮によって検出される。一見単純なプロセスですが、cAMP研究用のFRETバイオセンサーには多くの制限と問題があります5。その一つは、蛍光タンパク質、例えばGFPの選択であり、これは自然に二量体化することができ、したがって感度を低下させることができる6。FRETベースのcAMPバイオセンサーは、特定のマイクロドメインを標的としてきました7が、2つの蛍光色素を持つコンストラクトのサイズが大きいため、制限がある場合があります6。もう1つの重要な問題は、蛍光色素の励起と放出の重なりから生じるFRET信号の信号対雑音比が低く、サンプリング周波数が高くなり、結果の解析が複雑になることです4,5。
最近では、新しいバイオセンサー(cAMP Difference Detector In Situ)であるcADDisが、cAMPシグナル伝達の制御を研究する際のこれらの制限やその他の制限を解決しました8。重要な改善点の1つは、単一の蛍光色素への依存性です。これにより、より広いダイナミックレンジと高いS/N比で、迅速かつ効率的な信号を得ることができます。その結果、8をくまなく調べる波長の範囲が狭くなるため、精度が向上する可能性があります。FRETプローブと同様に、バイオセンサーは細胞内位置を標的としており、脂質ラフトと非ラフト、およびその他の細胞内ドメイン9におけるコンパートメント化理論の研究と探索を可能にしている。おそらく最も重要なのは、単一の蛍光色素バイオセンサーがハイスループットスクリーニングに適していることであり、FRETベースのバイオセンサーよりも感度と再現性が向上しています。バイオセンサーはBacMamベクターにパッケージ化されており、さまざまな細胞タイプの形質導入を容易にし、タンパク質発現を正確に制御できます。
BacMamベクター による 発現制御は、動物実験のデータの解釈を容易にするために、異なる種由来のGPCRオルソログを用いたアッセイに特に有用です。さらに、受容体発現の制御は、さまざまな程度の薬物効果(例えば、インバースアゴニストおよびパーシャルアゴニスト)を測定するために重要であり、低レベルの受容体発現は、動物組織に見られる低レベルを模倣するために有用である。BacMamは、初代細胞培養やHEK-293系統10などの哺乳類細胞に形質導入するように改変されたバキュロウイルスベクターです。優勢な選択マーカーにより、BacMamは従来のプラスミド感染症よりも安定性を高めることができます11。このような選択的プロモーターは、より効率的な遺伝子導入と発現を可能にします。さらに、トリコスタチンA(ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤)を添加すると、レポータータンパク質レベルが増強されます11。発現レベルは、使用するBacMamウイルスの力価 で 制御でき、細胞タイプごとに最適化する必要があります。このバイオセンサーの場合、赤または緑の蛍光タンパク質がN末端とC末端でEpacに結合しています。cAMPが結合すると、バイオセンサーのコンフォメーション変化により、蛍光タンパク質に隣接するアミノ酸が移動します。このようなシフトにより、吸光度は400nmで陰イオン状態から中性状態に移動し、蛍光が減少します。
1つの細胞に発現する90〜120のGPCRがあり、さまざまな神経液性シグナルに応答します12。したがって、細胞あたり少なくとも数十のGPCRが、それぞれGsまたはGiカップリングを介してcAMPを刺激または阻害できると仮定できます。FRETなど、このセカンドメッセンジャーをリアルタイムで監視する動きは進んでいますが、より効率的な方法が求められています。ここでは、cADDisを使用してcAMP信号の合成と劣化をリアルタイムでモニタリングする方法論を紹介します。蛍光の変化は、ハイスループットアッセイには蛍光プレートリーダーを使用し、シングルセルアッセイには蛍光顕微鏡を使用して、リアルタイムでモニタリングできます。これらの方法は、cAMP を介した GPCRシグナル伝達に関するさまざまな生物学的問題に役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
cAMPの正確で高感度な測定は、さまざまな細胞プロセスにおけるcAMPの役割を理解し、cAMP依存性シグナル伝達経路の活性を研究するために重要です。cAMPレベルの測定には、ELISA、ラジオイムノアッセイ、FRETバイオセンサー、GloSensor cAMPアッセイ14、15、16、17、18など、いく?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、National Heart, Lung, and Blood Institute(NHLBI)(HL169522)の支援を受けました。
Materials
| 96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| 35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
| 96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
| BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
| Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
| Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
| DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
| DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
| Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
| Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
| Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
| Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
| RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
| Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
| Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
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