Dinamica del cAMP in tempo reale in cellule vive utilizzando il rivelatore di differenza fluorescente cAMP in situ
Summary
Il protocollo presentato in questo studio illustra l’efficacia del cAMP Difference Detector In Situ nella misurazione del cAMP attraverso due metodi. Un metodo utilizza uno spettrofotometro per la lettura di piastre a 96 pozzetti con celle HEK-293. L’altro metodo dimostra le singole cellule HASM sotto un microscopio a fluorescenza.
Abstract
cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) è un nuovo biosensore che consente la misurazione continua dei livelli di cAMP nelle cellule viventi. Il biosensore è creato da una proteina fluorescente permutata circolarmente legata alla regione cerniera di Epac2. Questo crea un singolo biosensore fluoroforo che mostra un aumento o una diminuzione della fluorescenza al legame del cAMP. Il biosensore esiste nelle versioni rosse e verdi verso l’alto, così come nelle versioni verdi verso il basso e in diverse versioni rosse e verdi mirate alle posizioni subcellulari. Per illustrare l’efficacia del biosensore, è stata utilizzata la versione verde verso il basso, che diminuisce in fluorescenza dopo il legame con il cAMP. Vengono dimostrati due protocolli che utilizzano questo sensore: uno che utilizza uno spettrofotometro di lettura a piastra a 96 pozzetti compatibile con lo screening ad alto rendimento e un altro che utilizza l’imaging a singola cellula su un microscopio a fluorescenza. Sul lettore di piastre, le cellule HEK-293 coltivate in piastre a 96 pozzetti sono state stimolate con 10 μM di forskolina o 10 nM di isoproterenolo, che ha indotto rapide e ampie diminuzioni della fluorescenza nella versione verde verso il basso. Il biosensore è stato utilizzato per misurare i livelli di cAMP in singole cellule muscolari lisce delle vie aeree umane (HASM) monitorate al microscopio a fluorescenza. Il biosensore verde verso il basso ha mostrato risposte simili a popolazioni di cellule quando stimolato con forskolina o isoproterenolo. Questo test a singola cellula consente la visualizzazione della posizione del biosensore con un ingrandimento di 20x e 40x. Pertanto, questo biosensore di cAMP è sensibile e flessibile e consente la misurazione in tempo reale del cAMP sia in cellule immortalizzate che primarie e con singole cellule o popolazioni di cellule. Questi attributi rendono cADDis uno strumento prezioso per studiare le dinamiche di segnalazione del cAMP nelle cellule viventi.
Introduction
L’adenosina 3′,5′-monofosfato ciclico, cAMP, svolge un ruolo centrale nella comunicazione cellulare e nel coordinamento di vari processi fisiologici. Il cAMP agisce come un secondo messaggero, trasmettendo segnali esterni da ormoni, neurotrasmettitori o altre molecole extracellulari per avviare una cascata di eventi intracellulari1. Inoltre, il cAMP è coinvolto in modo complesso in varie vie di segnalazione, comprese quelle associate ai recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e alle adenilil ciclasi. Comprendere il ruolo del cAMP nella segnalazione cellulare è fondamentale per svelare i complessi meccanismi che sono alla base delle normali funzioni cellulari e per lo sviluppo di potenziali terapie per un’ampia gamma di condizioni mediche2.
In passato, sono stati impiegati vari metodi per misurare il cAMP direttamente o indirettamente. Questi includevano la radiomarcatura dei pool cellulari di ATP seguita da purificazione della colonna, HPLC, saggi radioimmunologici e saggi immunologici enzimatici 1,2. Questi saggi legacy sono limitati dal fatto che si tratta di misure end-point, che richiedono un gran numero di campioni per costruire risposte dipendenti dal tempo. Più recentemente, i sensori FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) sono stati sviluppati per creare saggi nelle cellule viventi, producendo dati dinamici in tempo reale e consentendo ai sensori di essere indirizzati in diverse posizioni subcellulari3. FRET sfrutta due fluorofori, un donatore fluorescente e un accettore fluorescente che, quando si trovano nelle immediate vicinanze, il fluoroforo accettore sarà eccitato dall’uscita fluorescente del donatore. I due fluorofori più utilizzati sono la proteina fluorescente ciano (CFP) e la proteina fluorescente gialla (YFP) poiché hanno proprietà di eccitazione ed emissione compatibili. Oltre a CFP e YFP, l’utilizzo della proteina fluorescente verde (GFP) e della proteina fluorescente rossa (RFP) è comunemente utilizzato per i biosensori FRET. I biosensori FRET cAMP funzionano con un donatore e un accettore alle estremità opposte della proteina legante il cAMP Epac2. Il legame cAMP altera la conferma di Epac e aumenta la distanza tra i fluorofori donatore e accettore 3,4. Questo cambiamento conformazionale è rilevato da una perdita di FRET, cioè dall’eccitazione del fluoroforo accettore da parte dell’energia trasferita dalle gocce di fluoroforo donatore3. Sebbene sia un processo apparentemente semplice, ci sono molte limitazioni e problemi con il biosensore FRET per la ricerca cAMP5. Uno dei quali è la selezione di proteine fluorescenti, ad esempio la GFP, che possono dimerizzare naturalmente, riducendo così la sensibilità6. I biosensori cAMP basati su FRET sono stati mirati a specifici microdomini7, ma potrebbero esserci limitazioni a causa delle grandi dimensioni di un costrutto con due fluorofori6. Un altro problema significativo è il basso rapporto segnale/rumore dei segnali FRET risultante dalla sovrapposizione tra eccitazione ed emissione del fluoroforo, con conseguente elevata frequenza di campionamento e complicando l’analisi dei risultati 4,5.
Più recentemente, il nuovo biosensore (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis ha risolto queste e altre limitazioni quando si tratta di studiare la regolazione della segnalazione cAMP8. Un miglioramento importante è la dipendenza da un singolo fluoroforo. Ciò consente di ottenere un segnale rapido ed efficiente con una gamma dinamica più ampia e un elevato rapporto segnale/rumore. Di conseguenza, ci può essere una maggiore precisione in quanto c’è una gamma meno ampia di lunghezze d’onda da pettinare8. Come le sonde FRET, il biosensore è stato mirato alle posizioni subcellulari, consentendo la ricerca sulla teoria della compartimentazione e l’esplorazione in zattere lipidiche e non-zattere e altri domini subcellulari9. Forse la cosa più importante è l’idoneità di un singolo biosensore fluoroforo per lo screening ad alto rendimento, che ha migliorato la sensibilità e la riproducibilità rispetto ai biosensori basati su FRET. Il biosensore è inserito in un vettore BacMam per una facile trasduzione di un’ampia gamma di tipi di cellule e un controllo preciso sull’espressione proteica.
Il controllo dell’espressione tramite il vettore BacMam può essere particolarmente utile nei saggi che utilizzano ortologhi GPCR di specie diverse per facilitare l’interpretazione dei dati provenienti da studi sugli animali. Inoltre, il controllo sull’espressione dei recettori è fondamentale per misurare i diversi gradi di efficacia dei farmaci (ad esempio, agonisti inversi e agonisti parziali), e bassi livelli di espressione dei recettori sono utili per imitare i bassi livelli riscontrati nei tessuti animali. BacMam è un vettore di baculovirus che è stato modificato per trasdurre cellule di mammifero come colture cellulari primarie e linee HEK-29310. I marcatori dominanti selezionabili consentono a BacMam di fornire una maggiore stabilità rispetto alle tradizionali infezioni plasmidiche11. Tali promotori selettivi consentono una consegna e un’espressione genica più efficienti. Inoltre, l’aggiunta di tricostatina A (un inibitore dell’istone deacetilasi) aumenta i livelli di proteina reporter11. I livelli di espressione possono essere controllati tramite il titolo del virus BacMam utilizzato e devono essere ottimizzati per ogni tipo di cellula. Nel caso di questo biosensore, una proteina fluorescente rossa o verde è legata all’Epac ai terminali N e C. Quando il cAMP si lega, un cambiamento conformazionale nel biosensore sposta gli amminoacidi adiacenti alla proteina fluorescente. Tale spostamento sposta l’assorbanza dallo stato anionico allo stato neutro a 400 nm, diminuendo così la fluorescenza.
Ci sono 90-120 GPCR espressi in una singola cellula che rispondono a un’ampia varietà di segnali neuroumorali12. Pertanto, si può ipotizzare che almeno diverse dozzine di GPCR per cellula possano stimolare o inibire il cAMP attraverso l’accoppiamento Gs o Gi, rispettivamente. Sebbene siano stati compiuti progressi nel monitoraggio di questo secondo messenger in tempo reale, come FRET, sono necessari metodi più efficienti. Qui viene presentata la metodologia per monitorare la sintesi e la degradazione dei segnali cAMP utilizzando cADDis in tempo reale. La variazione della fluorescenza può essere monitorata in tempo reale utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza per saggi ad alta produttività o utilizzando un microscopio a fluorescenza per saggi su singola cellula. Questi metodi sono utili per un’ampia gamma di questioni biologiche riguardanti la segnalazione GPCR tramite cAMP.
Protocol
Representative Results
Discussion
Una misurazione accurata e sensibile del cAMP è fondamentale per comprendere il suo ruolo in vari processi cellulari e per studiare l’attività delle vie di segnalazione dipendenti dal cAMP. Esistono diversi metodi comunemente impiegati per misurare i livelli di cAMP, tra cui ELISA, test radioimmunologico, biosensori FRET e il test cAMP GloSensor 14,15,16,17,18.</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (HL169522).
Materials
| 96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| 35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
| 96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
| BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
| Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
| Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
| DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
| DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
| Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
| Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
| Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
| Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
| RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
| Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
| Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
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