In Situ Fluorescent cAMP Difference Detector를 사용한 살아있는 세포의 실시간 cAMP 역학
Summary
이 연구에서 제시된 프로토콜은 두 가지 방법을 통해 cAMP를 측정하는 데 있어 cAMP Difference Detector In Situ 의 효과를 보여줍니다. 한 가지 방법은 HEK-293 셀이 있는 96웰 플레이트 판독 분광 광도계를 사용하는 것입니다. 다른 방법은 형광 현미경으로 개별 HASM 세포를 보여줍니다.
Abstract
cAMP Difference Detector In Situ (cADDis)는 살아있는 세포의 cAMP 수준을 지속적으로 측정할 수 있는 새로운 바이오센서입니다. 바이오센서는 Epac2의 힌지 영역에 연결된 원형 치환 형광 단백질로 만들어집니다. 이것은 cAMP의 결합 시 증가하거나 감소된 형광을 표시하는 단일 형광단 바이오센서를 생성합니다. 바이오센서는 적색 및 녹색 상향 버전뿐만 아니라 녹색 하향 버전, 그리고 세포 내 위치를 대상으로 하는 여러 적색 및 녹색 버전으로 존재합니다. 바이오센서의 효과를 설명하기 위해, cAMP 결합시 형광이 감소하는 녹색 하향 버전이 사용되었습니다. 이 센서를 사용하는 두 가지 프로토콜, 즉 고처리량 스크리닝과 호환되는 96웰 플레이트 판독 분광 광도계를 사용하는 프로토콜과 형광 현미경에서 단일 세포 이미징을 사용하는 프로토콜이 시연됩니다. 플레이트 리더에서 96웰 플레이트에서 배양된 HEK-293 세포를 10μM 포스콜린 또는 10nM 이소프로테레놀로 자극하여 녹색 하향 버전에서 형광의 빠르고 큰 감소를 유도했습니다. 바이오센서는 형광 현미경으로 모니터링한 개별 인간 기도 평활근(HASM) 세포의 cAMP 수준을 측정하는 데 사용되었습니다. 녹색 하향 바이오센서는 포스콜린(forskolin) 또는 이소프로테레놀(isoproterenol)로 자극되었을 때 세포 집단에 유사한 반응을 보였습니다. 이 단일 세포 분석을 통해 20x 및 40x 배율로 바이오센서 위치를 시각화할 수 있습니다. 따라서 이 cAMP 바이오센서는 민감하고 유연하여 불멸화된 세포와 일차 세포 모두에서, 그리고 단일 세포 또는 세포 집단에서 cAMP를 실시간으로 측정할 수 있습니다. 이러한 특성으로 인해 cADDis는 살아있는 세포의 cAMP 신호 역학을 연구하는 데 유용한 도구입니다.
Introduction
아데노신 3′,5′-고리형 일인산염(cAMP)은 세포 통신 및 다양한 생리적 과정의 조정에서 중심적인 역할을 합니다. cAMP는 호르몬, 신경전달물질 또는 기타 세포외 분자의 외부 신호를 전달하는 두 번째 메신저 역할을 하여 세포 내 사건의 연쇄 반응을 시작합니다1. 또한 cAMP는 G-단백질 결합 수용체(GPCR) 및 아데닐릴 사이클라제와 관련된 경로를 포함하여 다양한 신호 전달 경로에 복잡하게 관여합니다. 세포 신호 전달에서 cAMP의 역할을 이해하는 것은 정상적인 세포 기능의 기초가 되는 복잡한 메커니즘을 밝히고 광범위한 의학적 상태에 대한 잠재적 치료법을 개발하는 데 필수적입니다2.
과거에는 cAMP를 직접 또는 간접적으로 측정하기 위해 다양한 방법이 사용되었습니다. 여기에는 세포 ATP 풀의 방사선 표지와 컬럼 정제, HPLC, 방사성 면역 분석 및 효소 결합 면역 분석이 포함되었습니다 1,2. 이러한 레거시 분석은 종말점 측정이라는 사실에 의해 제한되며, 시간 종속 반응을 구성하기 위해 많은 수의 샘플이 필요합니다. 보다 최근에는 FRET(Fluorescence Resonance Energy Transfer) 센서가 개발되어 살아있는 세포에서 분석을 생성하여 실시간 동적 데이터를 생성하고 다양한 세포 내 위치에서 센서를 표적으로 할 수 있습니다3. FRET는 2개의 형광단, 1개의 형광 공여체 및 1개의 형광 수용체를 활용하여 근접할 때 수용체 형광단이 공여체 형광 출력에 의해 여기됩니다. 가장 많이 사용되는 두 가지 형광단은 청록색 형광 단백질(CFP)과 황색 형광 단백질(YFP)인데, 이는 두 가지가 서로 호환되는 여기 및 방출 특성을 가지고 있기 때문입니다. CFP 및 YFP 외에도 녹색 형광 단백질(GFP) 및 적색 형광 단백질(RFP)의 활용은 일반적으로 FRET 바이오센서에 사용됩니다. cAMP FRET 바이오센서는 Epac2 cAMP 결합 단백질의 반대쪽 끝에 공여체와 수용체를 두고 작동합니다. cAMP 결합은 Epac의 확인을 변경하고 donor와 acceptor fluorophores 사이의 거리를 증가시킵니다 3,4. 이러한 구조적 변화는 FRET의 손실, 즉 donor fluorophore drops3에서 전달된 에너지에 의한 acceptor fluorophore의 excitation에 의해 감지됩니다. 겉보기에는 간단해 보이지만, cAMP 연구를 위한 FRET 바이오센서에는 많은 한계와 문제가 있다5. 그 중 하나는 형광 단백질, 예를 들어 GFP를 선택하는 것인데, 이는 자연적으로 이합체화될 수 있어 감도를 감소시킬 수 있습니다6. FRET 기반 cAMP 바이오센서는 특정 마이크로도메인(microdomain)7을 대상으로 되어 왔지만, 2개의 형광단(fluorophore)6을 가진 구조체의 크기가 크기 때문에 한계가 있을 수 있다. 또 다른 중요한 문제는 형광단의 여기(excitation)와 방출 사이의 중첩으로 인해 발생하는 FRET 신호의 낮은 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)로, 이로 인해 샘플링 빈도가 높아지고 결과 분석이 복잡해진다 4,5.
가장 최근에는 새로운 바이오센서(cAMP Difference Detector In Situ)인 cADDis가 cAMP 신호전달 조절을 연구할 때 이러한 한계와 기타 한계를 해결했다8. 한 가지 중요한 개선 사항은 단일 형광단에 대한 의존성입니다. 이를 통해 더 넓은 다이내믹 레인지와 높은 신호 대 잡음비로 빠르고 효율적인 신호를 얻을 수 있습니다. 결과적으로8을 통해 빗질할 파장 범위가 덜 넓기 때문에 정확도가 더 높을 수 있습니다. FRET 프로브와 마찬가지로 바이오센서는 세포 내 위치를 대상으로 하여 구획화 이론에 대한 연구와 지질 뗏목 및 비뗏목 및 기타 세포 내 영역에서의 탐색을 가능하게 했습니다9. 아마도 가장 중요한 것은 고처리량 스크리닝을 위한 단일 형광단 바이오센서의 적합성이며, 이는 FRET 기반 바이오센서에 비해 감도와 재현성이 향상되었습니다. 이 바이오센서는 다양한 세포 유형의 transduction을 쉽게 구현하고 단백질 발현을 정밀하게 제어할 수 있도록 BacMam 벡터로 패키징되어 있습니다.
BacMam 벡터를 통한 발현 제어는 동물 연구의 데이터 해석을 용이하게 하기 위해 다양한 종의 GPCR ortholog를 사용하는 분석에서 특히 유용할 수 있습니다. 또한, 수용체 발현에 대한 제어는 약물 효능의 다양한 정도(예: 역 작용제 및 부분 작용제)를 측정하는 데 중요하며, 낮은 수준의 수용체 발현은 동물 조직에서 발견되는 낮은 수준을 모방하는 데 유용합니다. BacMam은 1차 세포 배양 및 HEK-293 라인10과 같은 포유류 세포를 transduction하도록 변형된 baculovirus 벡터입니다. 우세한 선택 가능한 마커는 BacMam이 기존 플라스미드 감염에 비해 더 많은 안정성을 제공할 수 있도록 합니다11. 이러한 선택적 프로모터는 보다 효율적인 유전자 전달 및 발현을 가능하게 한다. 또한 트리코스타틴 A(히스톤 탈아세틸화효소 억제제)를 추가하면 리포터 단백질 수치가11 향상됩니다. 발현 수준은 사용된 BacMam 바이러스의 역가를 통해 제어할 수 있으며 각 세포 유형에 맞게 최적화해야 합니다. 이 바이오센서의 경우, 적색 또는 녹색 형광 단백질이 N- 및 C-말단에서 Epac에 연결됩니다. cAMP가 결합할 때, 바이오센서의 구조적 변화는 형광 단백질에 인접한 아미노산을 이동시킵니다. 이러한 이동은 흡광도를 400nm에서 음이온 상태에서 중성 상태로 이동시켜 형광을 감소시킵니다.
단일 세포에서 발현되는 90-120개의 GPCR이 있으며, 이들은 다양한 신경체액 신호에 반응한다12. 따라서, 세포당 적어도 수십 개의 GPCR이 각각 Gs 또는 Gi 커플링을 통해 cAMP를 자극하거나 억제할 수 있다는 가설을 세울 수 있다. FRET와 같이 이 두 번째 메신저를 실시간으로 모니터링하는 데 진전이 있었지만 보다 효율적인 방법이 필요합니다. cADDis를 사용하여 실시간으로 cAMP 신호의 합성 및 저하를 모니터링하는 방법론이 여기에 나와 있습니다. 고처리량 분석을 위해 형광 플레이트 리더를 사용하거나 단일 세포 분석을 위해 형광 현미경을 사용하여 형광의 변화를 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 이러한 방법은 cAMP를 통한 GPCR 신호전달과 관련된 다양한 생물학적 질문에 유용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
cAMP의 정확하고 감도 높은 측정은 다양한 세포 과정에서 cAMP의 역할을 이해하고 cAMP 의존성 신호 경로의 활성을 연구하는 데 매우 중요합니다. ELISA, 방사성 면역 분석법, FRET 바이오센서 및 GloSensor cAMP 분석 14,15,16,17,18을 포함하여 cAMP 수준을 측정하는 데 일반적으로 사용되는…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 미국 국립심장폐혈액연구소(National Heart, Lung, and Blood Institute, NHLBI)(HL169522)의 지원을 받았다.
Materials
| 96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
| 35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
| 96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
| BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
| Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
| Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
| DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
| DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
| DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
| Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
| Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
| Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
| Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
| L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
| Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
| Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
| RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
| Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
| Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
| Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
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