Identification microbienne directe à l’aide d’un système automatisé d’identification microbienne pour faciliter la méthode RAST d’EUCAST sans spectrométrie de masse

Summary

EUCAST a développé un protocole de test direct de sensibilité aux antimicrobiens (AST) pour les hémocultures automatisées. Cependant, sa dépendance à l’identification microbienne basée sur la spectrométrie de masse peut être évitée en utilisant un protocole de préparation directe de l’inoculum dans un système automatisé d’identification microbienne. Cette approche permet de fournir des rapports AST dans les 24 heures suivant le prélèvement de l’échantillon.

Abstract

Le sepsis à Gram négatif (GN) est une urgence médicale où la prise en charge dans des contextes à ressources limitées repose sur des techniques de culture microbiologique conventionnelles qui donnent des résultats en 3 à 4 jours. Reconnaissant ce délai d’exécution (TAT), EUCAST et CLSI ont développé des protocoles pour déterminer les résultats de l’AST directement à partir de flacons d’hémoculture automatisés (+aBC) signalés positivement. Le protocole EUCAST rapid AST (RAST) a été introduit pour la première fois en 2018, où les points de rupture du diamètre de zone pour quatre agents étiologiques courants du septicémie GN, à savoir Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et le complexe Acinetobacter baumannii peuvent être rapportés. Cependant, les laboratoires cliniques qui ont mis en œuvre cette méthode dans leur flux de travail de routine s’appuient sur l’identification microbienne basée sur la spectrométrie de masse, qui n’est pas facilement disponible, ce qui empêche sa mise en œuvre dans des contextes aux ressources limitées. Pour contourner ce problème, nous avons évalué un protocole d’inoculum direct (DIP) à l’aide d’un système commercial automatisé d’identification microbienne et de test de sensibilité aux antimicrobiens (aMIAST) pour permettre une identification microbienne précoce dans les 8 heures suivant le signalement positif d’aBC. Nous avons évalué ce protocole de janvier à octobre 2023 afin d’identifier les quatre GN À DÉCLARATION RAST (RR-GN) dans l’aBC signalé positivement. Les résultats de l’identification microbienne dans le DIP ont été comparés au protocole standard de préparation de l’inoculum (SIP) dans l’aMIAST. Sur 204 +aBC avec GN monomorphe (+naBC), l’un des 4 RR-GN a été identifié dans 105 +naBC par SIP (E. coli : 50, K. pneumoniae : 20, P. aeruginosa : 9 et complexe A. baumannii : 26). De ce nombre, 94 % (98/105) ont été correctement identifiés par le DIP, tandis que les taux d’erreurs majeures et d’erreurs très importantes étaient de 6 % (7/105) et de 1,7 % (4/240), respectivement. Lorsque la DIP pour l’identification microbienne est effectuée à l’aide de la méthode EUCAST RAST, des rapports cliniques provisoires peuvent être fournis dans les 24 heures suivant la réception de l’échantillon. Cette approche a le potentiel de réduire considérablement le TAT, ce qui permettra l’instauration précoce d’un traitement antimicrobien approprié.

Introduction

La septicémie, un problème de santé mondial important, est définie comme un dysfonctionnement d’organe potentiellement mortel dû à une réponse déréglée de l’hôte à l’infection. L’étude sur la charge mondiale des maladies a estimé qu’il y avait 48,9 millions de cas de septicémie et 11 millions de décès liés à la septicémie dans le monde en 2017, ce qui représentait près de 20 % de tous les décès dans le monde¹. Environ 2/^{3 des infections} du sang (BSI) causant la mortalité sont dues à des agents pathogènes bactériens à Gram négatif². Les principales causes de mortalité chez les Gram négatifs (GN) sont Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii, qui représentent environ 40 % des cas parmi 33 bactéries pathogènes².

Les hémocultures restent la référence pour diagnostiquer l’ISO, et l’identification microbienne rapide ainsi que les résultats des tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) sont la clé de la prise en charge. On a estimé qu’il y a une augmentation de 9 % des risques de mortalité avec un retard d’une heure dans l’instauration d’antimicrobiens appropriés dans le sepsis³. Le délai d’exécution (TAT) des rapports d’hémoculture microbiologiquement positifs avec des résultats AST est d’environ 48 à 72 heures avec les outils microbiologiques disponibles dans les environnements à ressources limitées, même avec des systèmes automatisés. En raison de cette TAT médiocre, des antimicrobiens à large spectre sont utilisés empiriquement, ce qui contribue au problème croissant de la résistance aux antimicrobiens (RAM). Reconnaissant ce besoin urgent de réduire la TAT pour les techniques de culture microbiologique pour le sepsis, EUCAST et CLSI s’orientent vers la réalisation de l’AST directement à partir de flacons d’hémoculture signalés positivement (+aBC)^4,5.

En 2018, EUCAST a introduit pour la première fois la méthode AST rapide (RAST) pour déterminer l’AST par la méthode de diffusion sur disque Kirby-Bauer à des temps d’incubation courts, c’est-à-dire 4 h, 6 h et 8 h, directement à partir de +aBC ^6,7. La méthode est actuellement validée pour déterminer l’AST pour les +aBC contenant l’une des 8 causes les plus courantes de BSI, à savoir E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa et le complexe A. baumannii parmi les gram-négatifs et Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium et Streptococcus pneumoniae parmi les gram-positifs⁸. Les points de rupture pour la détermination de l’AST à divers intervalles de temps sont fournis en fonction des espèces microbiennes énumérées ci-dessus. Par conséquent, avant une interprétation catégorique des résultats de l’AST, l’identification microbienne est nécessaire. Cependant, la norme RAST ne spécifie pas la méthode permettant l’identification microbienne dans ce laps de temps.

La majorité des études évaluant la méthode RAST d’EUCAST dans leur contexte ont utilisé l’identification microbienne basée sur la spectrométrie de masse après une courte incubation sur des milieux plaqués^pour identifier les micro-organismes 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Cependant, les instruments de spectrométrie de masse ne sont pas largement disponibles, en particulier dans les pays à revenu faible ou intermédiaire (PRFI), ce qui limite considérablement l’utilité potentielle de cette méthode. Peu d’études ont rapporté la mise en œuvre de cette méthode dans leurs centres sans utiliser la spectrométrie de masse 18,19,20. Tayşi et ^al.18 ont signalé une large catégorisation de la GN parmi les Enterobacterales, les Pseudomonas et les Acinetobacter spp., sur la base de la morphologie de la coloration de Gram et du test d’oxydase avant d’interpréter les résultats de l’AST. Dans d’autres études menées par ce centre, par Gupta et ^al.19 et Siddiqui et ^al.20, l’identification microbienne au niveau de l’espèce a été effectuée en préparant une pastille bactérienne à partir du mélange de sang et de bouillon signalé positivement et en l’inoculant sur les tests biochimiques conventionnels. Bien que Tayşi et ^coll.18 n’aient pas commenté l’exactitude de l’identification microbienne avec leur approche, Gupta et ^coll.19 ont signalé qu’avec leur approche dans 165/176 cas (94 %), un Gram négatif à déclaration obligatoire RAST (RR-GN), c’est-à-dire l’un ou l’autre des E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa et A. baumannii complexe. Cependant, avec cette dernière approche, la lecture des résultats RAST a été effectuée rétrospectivement en utilisant des points de rupture de diamètre de zone de 8 h seulement après l’incubation complète des résultats biochimiques conventionnels, c’est-à-dire 18 à 24 heures après l’inoculation, et le délai moyen de déclaration était d’environ 2 jours.

Afin de réduire davantage le TAT des rapports cliniques, nous proposons une méthodologie alternative pour permettre l’identification précoce des GN présents dans les +aBC à l’aide d’aMIAST. Avant l’introduction des systèmes d’identification microbienne basés sur la spectrométrie de masse, ces systèmes d’identification automatisés étaient considérés comme la norme de soins pour l’identification microbienne, où l’identification était rendue possible par des changements colorimétriques et/ou fluorométriques induits par les bactéries d’essai lorsqu’elles étaient inoculées dans des tests biochimiques miniaturisés hébergés dans une cassette et faisant correspondre les résultats avec leur base de données d’isolats. Le temps moyen d’identification dans ces systèmes est d’environ 4 h à 8 h, cependant, ils sont limités par le fait que les fabricants recommandent la croissance nocturne des microbes avant que leurs cartes d’identification respectives puissent être inoculées. Cette exigence limite considérablement leur utilité pour réduire le temps consacré aux rapports.

Peu d’études ont évalué les méthodes permettant d’identifier directement les microbes des +aBC à l’aide de ces systèmes automatisés 21,22,23,24,25,26,27. Dans le cas des +aBC contenant du GN monomorphe, la majorité des études ont montré une excellente concordance entre l’inoculation directe à partir de granules bactériennes fabriquées à partir d’un mélange sanguin-bouillon positif et l’incubation standard en colonie. Cependant, dans le cas des Gram positifs, les taux de concordance étaient sous-optimaux. Comme le temps moyen de positivité des +aBCs est compris entre 8 h et 16 h et que l’identification des GN prend ~4 h à 8 h dans un système d’identification microbienne automatisé, nous émettons l’hypothèse qu’en utilisant un protocole d’inoculation directe dans l’identification microbienne automatisée, nous pouvons compléter le rapport clinique des +aBCs avec GN ayant un RR-GN dans les 24 heures suivant la réception de l’échantillon.

Cadre de l’étude
La présente étude a été menée dans le laboratoire de bactériologie clinique d’un institut universitaire de soins tertiaires d’importance nationale (INI) de 950 lits dans le centre de l’Inde de janvier à octobre 2023. Le laboratoire est équipé d’un système de surveillance continue des hémocultures (CBCMS) et d’aMIAST. Le laboratoire de bactériologie fonctionne 24 heures sur 24 et des techniciens et des microbiologistes sont disponibles pour traiter et signaler tout flacon d’hémoculture signalé positivement (+BCa).

Méthodes microbiennes utilisées ici
Le déroulement de l’étude est illustré à la figure 1. Les +aBC présentant des GN monomorphes (+naBC) ont été traités par inoculation directe des cartes d’identification correspondantes pour permettre l’identification et l’AST à l’aide du protocole EUCAST RAST. Ces résultats ont été comparés à la méthode standard de soins (SoC) pour les +aBC, c’est-à-dire la sous-culture sur des milieux conventionnels à l’aide d’une gélose au sang de mouton (SBA), d’une gélose au chocolat (CA) et d’une gélose MacConkey (MA), incubée en aérobie pendant 16 à 24 h, suivie d’une identification et de cartes AST données par l’aMIAST lorsque des colonies isolées apparaissent. Les hémocultures montrant des cocci à Gram positif, des bacilles à Gram positif, des cellules de levure en herbe et ≥2 micro-organismes différents sur des supports de coloration de Gram initiaux ou en plaques ont été exclues de l’étude.

Protocol

L’étude, financée par la subvention de recherche intra-muros accordée au Dr Ayush Gupta par l’AIIMS Bhopal, a été approuvée par le Comité d’éthique humaine institutionnelle (IHEC) sous la lettre n° : IHEC- LOP/2022/IL072. REMARQUE : Un volume d’échantillon de 5 ml a été utilisé d’après les études réalisées par Quesada et coll.25 et Munoz-Davila et coll.27. 1. Protocole d’inoculum stan…

Representative Results

Résultats générauxAu cours de la période d’étude, 240 +naBC ont été identifiés par aMIAST à l’aide de DIP et SIP. De ce nombre, 15 % (36/240) des +naBC se sont révélés polymicrobiens après une nuit d’incubation sur le milieu plaqué. Sur les 204 +naBC, la proportion de RR-GN identifiés par SIP était de 51,5 % (105/204). Parmi eux, 47,6 % (50/105) étaient E . coli, 19 % (20/105) K. pneumoniae, 8,6 % (9/105) P. aeruginosa et 24,8 % (26/105) du complexe <…

Discussion

À l’aide du DIP, nous avons réussi à identifier les RR-GN avec une précision diagnostique considérable. L’ITT moyen après l’observation positive d’un cancer du sein aBC n’était que de 507 min (~ 8,5 h). Ainsi, lorsqu’elle est effectuée en conjonction avec la méthode EUCAST RAST pour la détermination de l’AST, elle peut donner l’identification de l’isolat à 8 h de temps de lecture de l’AST. Cette approche a le potentiel de mettre en œuvre la méthode EUCAST RAST, évitant ainsi la nécessit…

Materials

ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli