Identificazione microbica diretta utilizzando un sistema automatizzato di identificazione microbica per facilitare il metodo RAST EUCAST senza spettrometria di massa

Summary

EUCAST ha sviluppato un protocollo di test di suscettibilità antimicrobica (AST) diretto per le emocolture automatizzate. Tuttavia, la sua dipendenza dall’identificazione microbica basata sulla spettrometria di massa può essere ovviata utilizzando un protocollo di preparazione diretta dell’inoculo in un sistema automatizzato di identificazione microbica. Questo approccio può fornire rapporti AST entro 24 ore dalla raccolta del campione.

Abstract

La sepsi Gram-negativa (GN) è un’emergenza medica in cui la gestione in contesti con risorse limitate si basa su tecniche di coltura microbiologica convenzionali che forniscono risultati in 3-4 giorni. Riconoscendo questo ritardo nei tempi di risposta (TAT), sia EUCAST che CLSI hanno sviluppato protocolli per determinare i risultati dell’AST direttamente da flaconi di emocoltura automatizzati contrassegnati positivamente (+aBC). Il protocollo AST rapido EUCAST (RAST) è stato introdotto per la prima volta nel 2018, dove possono essere riportati i breakpoint del diametro della zona per quattro agenti eziologici comuni della sepsi GN, ovvero Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e complesso Acinetobacter baumannii . Tuttavia, i laboratori clinici che hanno implementato questo metodo nel loro flusso di lavoro di routine si affidano all’identificazione microbica basata sulla spettrometria di massa, che non è facilmente disponibile, precludendone così l’implementazione in contesti con risorse limitate. Per aggirarlo, abbiamo valutato un protocollo di inoculo diretto (DIP) utilizzando un sistema di identificazione microbica automatizzato commerciale e di test di suscettibilità antimicrobica (aMIAST) per consentire l’identificazione microbica precoce entro 8 ore dalla segnalazione positiva di aBC. Abbiamo valutato questo protocollo da gennaio a ottobre 2023 per identificare i quattro GN (RR-GN) RAST segnalabili nell’aBC contrassegnato positivamente. I risultati dell’identificazione microbica nella DIP sono stati confrontati con il protocollo standard di preparazione dell’inoculo (SIP) in aMIAST. Dei 204 +aBC con GN monomorfo (+naBC), uno dei 4 RR-GN è stato identificato in 105 +naBC mediante SIP (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 e complesso di A. baumannii : 26). Di questi, il 94% (98/105) è stato identificato correttamente dal DIP, mentre i tassi di errore maggiore e molto grave sono stati rispettivamente del 6% (7/105) e dell’1,7% (4/240). Quando la DIP per l’identificazione microbica viene eseguita utilizzando il metodo EUCAST RAST, i rapporti clinici provvisori possono essere forniti entro 24 ore dalla ricezione del campione. Questo approccio ha il potenziale per ridurre significativamente la TAT, consentendo l’istituzione precoce di un’appropriata terapia antimicrobica.

Introduction

La sepsi, un importante problema di salute globale, è definita come una disfunzione d’organo pericolosa per la vita a causa di una risposta disregolata dell’ospite all’infezione. Il Global Burden of Diseases Study ha stimato che nel 2017 ci sono stati 48,9 milioni di casi di sepsi e 11 milioni di decessi correlati alla sepsi in tutto il mondo, che hanno rappresentato quasi il 20% di tutti i decessi^globali1. Circa i 2/^{3 delle infezioni} del flusso sanguigno (BSI) che causano mortalità sono dovute a patogeni batterici gram-negativi². Le principali cause di mortalità tra i gram-negativi (GN) sono Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, che rappresentano circa il 40% dei casi tra 33 patogeni batterici².

Le emocolture rimangono il gold standard per la diagnosi di BSI e l’identificazione microbica rapida insieme ai risultati dei test di suscettibilità antimicrobica (AST) è la chiave per la gestione. È stato stimato che vi è un aumento del 9% delle probabilità di mortalità con ogni ora di ritardo nell’istituzione di antimicrobici appropriati nella sepsi³. Il tempo di consegna (TAT) dei referti di emocoltura microbiologicamente positivi con risultati AST è di circa 48-72 ore con gli strumenti microbiologici disponibili in contesti con risorse limitate, anche con sistemi automatizzati. Come risultato di questa TAT scadente, gli antimicrobici ad ampio spettro vengono utilizzati empiricamente, contribuendo al crescente problema della resistenza antimicrobica (AMR). Riconoscendo questa urgente necessità di ridurre la TAT per le tecniche di coltura microbiologica per la sepsi, EUCAST e CLSI si stanno muovendo verso l’esecuzione dell’AST direttamente da flaconi per emocoltura contrassegnati positivamente (+aBC)^4,5.

Nel 2018 EUCAST ha introdotto per la prima volta il metodo AST rapido (RAST) per determinare l’AST mediante il metodo di diffusione su disco Kirby-Bauer a tempi di incubazione brevi, ovvero 4 ore, 6 ore e 8 ore, direttamente da +aBC ^6,7. Il metodo è attualmente convalidato per determinare l’AST per +aBC contenenti una delle 8 cause più comuni di BSI, vale a dire E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii tra i gram-negativi e Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium e Streptococcus pneumoniae tra i gram-positivi⁸. I breakpoint per la determinazione dell’AST a vari intervalli di tempo sono forniti in base alle specie microbiche sopra elencate. Pertanto, prima dell’interpretazione categorica dei risultati dell’AST, è necessaria l’identificazione microbica. Tuttavia, lo standard RAST non specifica il metodo per consentire l’identificazione microbica entro questo lasso di tempo.

La maggior parte degli studi che valutano il metodo EUCAST RAST nel loro contesto hanno utilizzato l’identificazione microbica basata sulla spettrometria di massa dopo breve incubazione su terreni placcati per identificare i microrganismi 9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Tuttavia, gli strumenti di spettrometria di massa non sono ampiamente disponibili, soprattutto nei paesi a basso e medio reddito (LMIC), il che limita notevolmente la potenziale utilità di questo metodo. Pochi studi hanno riportato l’implementazione di questo metodo nei loro centri senza utilizzare la spettrometria di massa 18,19,20. Tayşi et ^al.18 hanno riportato un’ampia categorizzazione della GN tra Enterobacterales, Pseudomonas e Acinetobacter spp. basata sulla morfologia della colorazione di Gram e sul test dell’ossidasi prima di interpretare i risultati dell’AST. In altri studi di questo centro, di Gupta et ^al.19 e Siddiqui et ^al.20, l’identificazione microbica a livello di specie è stata effettuata preparando un pellet batterico dalla miscela di brodo di sangue contrassegnata positivamente e inoculandolo con i test biochimici convenzionali. Mentre Tayşi et ^al.18 non hanno commentato l’accuratezza dell’identificazione microbica con il loro approccio, Gupta et ^al.19 hanno riferito che con il loro approccio in 165/176 (94%) casi, un RAST segnalabile gram-negativo (RR-GN), cioè E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa e A. baumannii complesso. Tuttavia, con quest’ultimo approccio, la lettura dei risultati RAST è stata effettuata retrospettivamente utilizzando punti di interruzione del diametro della zona di 8 ore solo dopo l’incubazione completa dei risultati biochimici convenzionali, cioè 18-24 ore dopo l’inoculazione, e il tempo medio per la segnalazione è stato di circa 2 giorni.

Per ridurre ulteriormente il TAT dei referti clinici, proponiamo una metodologia alternativa per consentire l’identificazione precoce della GN presente nei +aBC utilizzando aMIAST. Prima dell’introduzione dei sistemi di identificazione microbica basati sulla spettrometria di massa, questi sistemi di identificazione automatizzata erano considerati lo standard di cura per l’identificazione microbica, in cui l’identificazione era resa possibile da cambiamenti colorimetrici e/o fluorimetrici indotti dai batteri in prova quando inoculati in test biochimici miniaturizzati ospitati in una cassetta e corrispondenti ai risultati con il loro database di isolati. Il tempo medio per l’identificazione in questi sistemi è di circa 4-8 ore, tuttavia, sono limitati dal fatto che i produttori raccomandano la crescita notturna dei microbi prima che le rispettive carte di identificazione possano essere inoculate. Questo requisito limita notevolmente la loro utilità nel ridurre i tempi di segnalazione.

Pochi studi hanno valutato metodi per identificare direttamente i microbi da +aBC utilizzando questi sistemi automatizzati 21,22,23,24,25,26,27. Nel caso di +aBC contenenti GN monomorfico, la maggior parte degli studi ha mostrato un’eccellente concordanza tra l’inoculazione diretta da pellet batterico ottenuto da una miscela positiva di brodo di sangue e l’incubazione standard di colonie. Tuttavia, nel caso dei gram-positivi, i tassi di concordanza erano subottimali. Poiché il tempo medio di positività dei +aBC è compreso tra 8 e 16 ore e l’identificazione del GN richiede da ~4 a 8 ore in un sistema automatizzato di identificazione microbica, ipotizziamo che, impiegando il protocollo di inoculazione diretta nell’identificazione microbica automatizzata, possiamo completare la refertazione clinica dei +aBC con GN con un RR-GN entro 24 ore dalla ricezione del campione.

Impostazione per lo studio
Il presente studio è stato condotto nel laboratorio di batteriologia clinica di un istituto accademico di assistenza terziaria di importanza nazionale (INI) da 950 posti letto nell’India centrale da gennaio a ottobre 2023. Il laboratorio è dotato di un sistema di monitoraggio in continuo dell’emocoltura (CBCMS) e di aMIAST. Il laboratorio di batteriologia è operativo 24 ore su 24 con la disponibilità di tecnici e microbiologi per l’elaborazione e la segnalazione di qualsiasi flacone di emocoltura contrassegnato positivamente (+aBCs).

Metodi microbici utilizzati qui
Il flusso di lavoro dello studio è mostrato nella Figura 1. I +aBC che mostrano GN monomorfi (+naBC) sono stati elaborati mediante inoculazione diretta delle corrispondenti carte d’identità per consentire l’identificazione e l’AST utilizzando il protocollo EUCAST RAST. Questi risultati sono stati confrontati con il metodo standard di cura (SoC) per i +aBC, ovvero la subcoltura su terreni convenzionali placcati attraverso agar di sangue di pecora (SBA), agar cioccolato (CA) e agar MacConkey (MA), incubati aerobicamente per 16-24 ore, seguiti da schede di identificazione e AST fornite da aMIAST quando compaiono colonie isolate. Sono state escluse dallo studio le emocolture che mostravano cocchi Gram-positivi, bacilli Gram-positivi, cellule di lievito in gemmazione e ≥2 diversi microrganismi sulla colorazione iniziale di Gram o sui terreni placcati.

Protocol

Lo studio, finanziato dalla sovvenzione per la ricerca intramurale concessa al Dr. Ayush Gupta dall’AIIMS Bhopal, è stato approvato dal Comitato Etico Umano Istituzionale (IHEC) con lettera n.: IHEC- LOP/2022/IL072. NOTA: È stato utilizzato un volume di campione di 5 ml sulla base degli studi condotti da Quesada et al.25 e Munoz-Davila et al.27. 1. Protocollo standard di inoculo (SIP) per l’identificazione batt…

Representative Results

Risultati generaliDurante il periodo di studio, 240 +naBC sono stati identificati da aMIAST utilizzando sia DIP che SIP. Di questi, il 15% (36/240) dei +naBC è risultato polimicrobico dopo l’incubazione notturna sul terreno piastrato. Dei 204 +naBC, la percentuale di RR-GN identificata dal SIP è stata del 51,5% (105/204). Tra questi, il 47,6% (50/105) era costituito da E. coli, il 19% (20/105) da K. pneumoniae, l’8,6% (9/105) da P. aeruginosa e il 24,8% (26/105) da A….

Discussion

Utilizzando la DIP, siamo riusciti a identificare gli RR-GN con una notevole accuratezza diagnostica. Il TTI medio dopo la segnalazione positiva di aBC è stato di soli 507 minuti (~ 8,5 ore). Pertanto, se eseguito in combinazione con il metodo EUCAST RAST per la determinazione dell’AST, può fornire l’identificazione dell’isolato a 8 ore di lettura AST. Questo approccio ha il potenziale per implementare il metodo EUCAST RAST ovviando alla necessità di un’identificazione basata sulla spettrometria di massa. Questo è un…

Materials

ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli