質量分析を伴わないEUCAST RAST法を容易にする自動微生物同定システムを用いた直接微生物同定(英語)
Summary
EUCASTは、自動血液培養のための直接抗菌剤感受性試験(AST)プロトコルを開発しました。しかし、質量分析に基づく微生物同定への依存は、自動微生物同定システムにおける直接接種調製プロトコルを使用することで回避することができます。このアプローチでは、サンプル収集から24時間以内にASTレポートを提供できます。
Abstract
グラム陰性(GN)敗血症は、リソースが限られている環境での管理が従来の微生物学的培養技術に依存している医療緊急事態であり、3〜4日で結果が得られます。このターンアラウンドタイム(TAT)の遅延を認識して、EUCASTとCLSIは、陽性フラグが立てられた自動血液培養ボトル(+aBC)から直接AST結果を決定するためのプロトコルを開発しました。EUCAST rapid AST (RAST) プロトコルは 2018 年に初めて導入され、GN 敗血症の 4 つの一般的な病因、すなわち大 腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、および アシネトバクター バウマニー 複合体のゾーン直径ブレークポイントを報告できます。しかし、この方法を日常的なワークフローに導入している臨床検査室は、質量分析法に基づく微生物同定に依存しており、これは容易に入手できないため、リソースが限られている環境でのこの分析法の導入は困難です。これを回避するために、市販の自動微生物同定および抗菌剤感受性試験システム(aMIAST)を使用して直接接種プロトコル(DIP)を評価し、aBCの陽性フラグから8時間以内の早期微生物同定を可能にしました。2023年1月から10月にかけてこのプロトコルを評価し、陽性フラグが立てられたaBCの4つのRAST報告可能GN(RR-GN)を特定しました。DIPにおける微生物同定結果を、aMIASTの標準的な接種物調製プロトコル(SIP)と比較した。単型GN(+naBC)を持つ204の+aBCのうち、4つのRR-GNのうちの1つがSIPによって105の+naBCで同定されました(大腸菌: 50、 K.pneumoniae: 20、 P.aeruginosa: 9 、A.baumannii 複合体:26)。これらのうち、94%(98/105)がDIPによって正しく識別されましたが、メジャーエラー率と非常にメジャーエラー率はそれぞれ6%(7/105)と1.7%(4/240)でした。EUCAST RAST法を使用して微生物同定のためのDIPを行うと、サンプルを受け取ってから24時間以内に暫定的な臨床レポートを提供できます。このアプローチは、TATを大幅に減少させる可能性を秘めており、適切な抗菌療法を早期に開始することを可能にします。
Introduction
敗血症は、重要な世界的な健康問題であり、感染に対する宿主の反応の調節不全による生命を脅かす臓器機能障害と定義されています。「Global Burden of Diseases Study」によると、2017年の世界の敗血症症例数は4,890万人、敗血症関連死者数は1,100万人で、これは全世界の死亡者数の約20%を占めています1。死亡を引き起こす血流感染症(BSI)の約2/ 3は、グラム陰性細菌性病原体によるものです2。グラム陰性菌(GN)の死亡原因としては、 大腸菌、 肺炎桿菌、 緑膿菌、ア シネトバクター・バウマニーが主な原因で、33種類の細菌性病原体のうち約40%を占めています2。
血液培養は依然としてBSIの診断のゴールドスタンダードであり、抗菌薬感受性試験(AST)の結果とともに微生物を迅速に同定することが管理の鍵となります。敗血症3では、適切な抗菌薬の投与が1時間遅れるごとに、死亡率が9%増加すると推定されています。AST結果を含む微生物学的に陽性の血液培養報告のターンアラウンドタイム(TAT)は、自動化されたシステムであっても、リソースが限られている環境で利用可能な微生物学的ツールを使用すると、約48〜72時間です。この標準以下のTATの結果として、広域スペクトルの抗菌薬が経験的に使用され、抗菌薬耐性(AMR)の問題が急増しています。敗血症の微生物学的培養技術のためのTATを削減するこの切実な必要性を認識して、EUCASTとCLSIは、陽性フラグが立てられた血液培養ボトル(+aBC)4,5から直接ASTを実行する方向に進んでいます。
2018年、EUCASTは、Kirby-Bauerディスク拡散法によるASTを短いインキュベーション時間、つまり4時間、6時間、8時間で+aBC 6,7から直接測定するための迅速AST(RAST)法を初めて導入しました。この方法は、BSIの8つの最も一般的な原因の1つであるグラム陰性菌のうち、大腸菌、肺炎桿菌、緑膿菌、A.バウマニー複合体、およびグラム陽性菌8のうち黄色ブドウ球菌、Enterococcus faecalis、E. faecium、 およびStreptococcus pneumoniaeを含む+aBCのASTを決定するために現在検証されています.さまざまな時間間隔でのAST測定のブレークポイントは、上記の微生物種ごとに提供されています。したがって、AST結果をカテゴリー別に解釈する前に、微生物の同定が必要です。ただし、RAST規格では、この時間枠内で微生物の同定を可能にする方法は指定されていません。
EUCAST RAST法を評価した研究の大部分は、微生物を同定するために、めっき培地上での短いインキュベーション後に質量分析に基づく微生物同定を使用していました9、10、11、12、13、14、15、16、17.しかし、質量分析装置は、特に低中所得国(LMIC)では広く利用できないため、この分析法の潜在的な有用性は大きく制限されています。質量分析を使用せずに、この方法をセンターで実施したことを報告した研究はほとんどありません18,19,20。Tayşi et al.18 は、AST 結果を解釈する前に、グラム染色形態とオキシダーゼ試験に基づいて、Enterobacterales、Pseudomonas、および Acinetobacter spp. の間で GN を広く分類したことを報告しました。このセンターの他の研究では、Guptaら19およびSiddiquiら20による、種レベルの微生物同定は、陽性フラグが立てられた血液ブロス混合物から細菌ペレットを調製し、従来の生化学的試験でそれを接種することによって行われました。Tayşi et al.18 は、彼らのアプローチによる微生物同定の正確さについてコメントしていませんが、Gupta et al.19 は、165/176 (94%) のケースでのアプローチにより、RAST 報告可能なグラム陰性 (RR-GN)、つまり、大腸菌、K. pneumoniae、P. aeruginosa、および A. baumannii のいずれかであると報告しましたコンプレックス。しかし、後者のアプローチでは、RAST結果の読み取りは、従来の生化学的結果の完全なインキュベーション後、すなわち接種後18-24時間後にのみ、8時間のゾーン直径のブレークポイントを使用して遡及的に行われ、報告の平均時間は約2日でした。
臨床報告のTATをさらに削減するために、aMIASTを使用して+aBCに存在するGNの早期同定を可能にする代替方法論を提案します。質量分析ベースの微生物同定システムが導入される前は、これらの自動同定システムは微生物同定の標準治療と考えられており、カセットに保存された小型の生化学試験で接種し、その結果を分離データベースと照合すると、試験細菌によって誘発される比色および/または蛍光の変化によって同定が可能になりました。これらのシステムでの識別までの平均時間は約4時間から8時間ですが、メーカーがそれぞれのIDカードを接種する前に微生物を一晩で増殖させることを推奨しているという事実によって制限されています。この要件により、レポート作成までの時間を短縮する際の有用性が大幅に制限されます。
これらの自動化システムを使用して+aBCから微生物を直接同定する方法を評価した研究はほとんどありません21、22、23、24、25、26、27。単形GNを含む+aBCの場合、大多数の研究で、陽性の血液とブロスの混合物から作られた細菌ペレットからの直接接種と標準的なコロニーインキュベーションとの間に優れた一致が示されました。しかし、グラム陽性の場合、一致率は最適ではありませんでした。+aBCsの平均陽性時間は8時間から16時間の間であり、GNの同定は自動微生物同定システムで~4時間から8時間かかるため、我々は、自動微生物同定に直接接種プロトコルを採用することにより、サンプル受領から24時間以内にRR-GNを有するGNを有する+aBCsの臨床報告を完了できると仮定しています。
研究のための設定
本研究は、2023年1月から10月にかけて、インド中部にある950床の学術的な国家重要三次医療機関(INI)の臨床細菌学研究室で実施されました。研究所には、持続血液培養モニタリングシステム(CBCMS)とaMIASTが装備されています。細菌学研究所は24時間体制で機能しており、陽性フラグが立てられた血液培養ボトル(+aBC)を処理し、報告するための技術者や微生物学者が利用できます。
ここで使用されている微生物の方法
この試験のワークフローを 図 1 に示します。単型GNs(+naBC)を示す+aBCは、対応するIDカードを直接接種して処理し、EUCAST RASTプロトコルを用いた同定とASTを可能にした。これらの結果は、+aBCsの標準治療(SoC)法、すなわち、羊の血液寒天培地(SBA)、チョコレート寒天培地(CA)、およびMacConkey寒天培地(MA)を介して従来のプレーテッド培地で継代培養し、16時間から24時間好気的にインキュベートした後、分離されたコロニーが現れたときにaMIASTによって識別およびASTカードを与える方法と比較されました。グラム陽性球菌、グラム陽性菌、出芽酵母細胞、および最初のグラム染色またはプレーティング培地で≥2種類の微生物を示す血液培養物は、研究から除外されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
DIPを用いて、RR-GNをかなりの診断精度で同定することに成功しました。aBCの陽性フラグ付け後の平均TTIはわずか507分(~8.5時間)でした。したがって、AST測定のためのEUCAST RAST法と組み合わせて使用すると、8時間のAST読み取り時間で分離物の同定を行うことができます。このアプローチは、EUCAST RAST法を実装する可能性を秘めており、質量分析ベースの同定の必要性を排除します。これは、EUCAST RA…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、AIIMSボパールからアユシュ・グプタ博士に与えられた学内研究助成金によって資金提供されました。私たちは、日常的および緊急時に熱心にテストを実施し、読み取った検査技師と研修医の貢献を認めます。
Materials
| ANTIMICROBIAL DISKS | |||
| Amikacin disk 30 µg | Himedia, Mumbai, India | SD035-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
| Amoxyclav disk (20/10 µg) | Himedia, Mumbai, India | SD063-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
| Cefotaxime disk 5 µg | Himedia, Mumbai, India | SD295E-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
| Ceftazidime disk 10 µg | Himedia, Mumbai, India | SD062A-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
| Ciprofloxacin disk (5 µg) | Himedia, Mumbai, India | SD060-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
| Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg) | Himedia, Mumbai, India | SD010-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
| Gentamicin disk 10 µg | Himedia, Mumbai, India | SD016-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
| Imipenem disk 10 µg | Himedia, Mumbai, India | SD073-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
| Levofloxacin disk 5 µg | Himedia, Mumbai, India | SD216-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
| Meropenem disk 10 µg | Himedia, Mumbai, India | SD727-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
| Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg) | Himedia, Mumbai, India | SD292E-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
| Tobramycin disk 10 µg | Himedia, Mumbai, India | SD044-1VL | Antimicrobial susceptibility testing |
| ATCC Escherichia coli 25922 | Microbiologics, Minnesota USA | 0335A | Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST |
| BacT-Alert 3D 480 | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | 412CM8423 | Continuous automated blood culture system |
| Biosafety cabinet II Type A2 | Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India | DFP-2/21-22/149 | For protection against hazardous and infectious agents and to maintain quality control |
| Blood agar base no. 2 | Himedia, Mumbai, India | M834-500G | Preparation of blood agar and chocolate agar |
| Clinical Centrifuge Model SP-8BL | Laby Instruments, Ambala, India | HLL/2021-22/021 | Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant |
| Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser | BrandTech, Essex CT, England | V1200 | Dispensing accurate amount of saline |
| MacConkey agar | Himedia, Mumbai, India | M008-500G | Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli |
| Micropipette (100-1000 µL) | Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India | NJ478162 | Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation |
| Micropipette tips (200-1000 µL) | Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India | 521020 | Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation |
| Mueller-Hinton agar | Himedia, Mumbai, India | M173-500G | Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion |
| Nichrome loop D-4 | Himedia, Mumbai, India | LA019 | For streaking onto culture media |
| Nichrome straight wire | Himedia, Mumbai, India | LA022 | For stab inoculation |
| Nulife sterile Gloves | MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India | For safety precautions | |
| Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer | Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA | 367815 | Obtaining pellet after second centrifugation |
| Sheep blood | Labline Trading Co., Hyderabad, India | 70014 | Preparation of blood agar and chocolate agar |
| SST II tube, Advance BD vacutainer | Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA | 367954 | Supernatant separation in first centrifugation |
| Sterile cotton swab (w/Wooden stick) | Himedia, Mumbai, India | PW005-1X500NO | Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing |
| Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc | Nihal Healthcare, Solan, India | 2213805NB2 | Preparing aliquots from +aBC |
| VITEK DensiCHEK McFarland reference kit | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | 422219 | Densitometer to check the turbidity of suspension |
| VITEK saline solution (0.45% NaCl) | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | V1204 | Adjustment of McFarland Standard turbidity |
| VITEK tube stand | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | 533306-4 REV | Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation |
| VITEK tubes | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | Tubes for inoculum preparation | |
| VITEK-2 Compact 60 | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | VKC15144 | Automated identification and AST system |
| VITEK-2 GN card | bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France | 21341 | Identification of Gram negative bacilli |
References
- Rudd, K. E., et al. Global, regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990–2017: analysis for the Global Burden of Disease Study. Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Ikuta, K. S., et al. Global mortality associated with 33 bacterial pathogens in 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 400 (10369), 2221-2248 (2022).
- Liu, V. X., et al. The timing of early antibiotics and hospital mortality in sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 196 (7), 856-863 (2017).
- EUCAST. Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
- Wayne, P. A. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2023).
- EUCAST. Methodology-EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2018).
- EUCAST. Zone diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 1.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2018).
- EUCAST. diameter breakpoints for rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from positive blood culture bottles. Version 6.1. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
- Soo, Y. T., Waled, S. N. M. B., Ng, S., Peh, Y. H., Chew, K. L. Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) directly from blood culture bottles. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (5), 993-998 (2020).
- Berinson, B., et al. EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST): Analytical performance and impact on patient management. J Antimicrob Chemother. 76 (5), 1332-1338 (2021).
- Strubbe, G., Messiaen, A. S., Vandendriessche, S., Verhasselt, B., Boelens, J. EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) compared to conventional susceptibility testing: implementation and potential added value in a tertiary hospital in Belgium. Acta Clinica Belgica: Int J Clin Lab Med. 78 (5), 385-391 (2023).
- Jasuja, J. K., Zimmermann, S., Burckhardt, I. Evaluation of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing (RAST) for positive blood cultures in clinical practice using a total lab automation. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 39 (7), 1305-1313 (2020).
- Martins, A., et al. Rapid antimicrobial susceptibility of Enterobacteriaceae by disk diffusion directly from blood culture bottles using the EUCAST RAST breakpoints. J Glob Antimicrob Resist. 22, 637-642 (2020).
- Ekwall-Larson, A., Fröding, I., Mert, B., Åkerlund, A., Özenci, V. Analytical performance and potential clinical utility of EUCAST rapid antimicrobial susceptibility testing in blood cultures after four hours of incubation. Microbiol Spectr. 11 (2), e0500122 (2023).
- Cerrudo, V., et al. Usefulness of EUCAST rapid antibiotic susceptibility breakpoints and screening cut-off values directly from blood cultures for the inference of β-lactam resistance mechanisms in Enterobacterales. JAC-Antimicrob Resist. 5 (1), dlad017 (2023).
- Shan, Y., et al. Evaluation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test for enterobacterales-containing blood cultures in China. J Clin Microbiol. 60 (4), e0255921 (2022).
- Jonasson, E., Matuschek, E., Kahlmeter, G. The EUCAST rapid disc diffusion method for antimicrobial susceptibility testing directly from positive blood culture bottles. J Antimicrob Chemother. 75 (4), 968-978 (2020).
- Tayşi, M. R., et al. Implementation of the EUCAST rapid antimicrobial susceptibility test (RAST) directly from positive blood culture bottles without the advanced identification systems. J Antimicrobial Chemotherapy. 77 (4), 1020-1026 (2022).
- Gupta, A., et al. A prospective study evaluating the effect of a ‘Diagnostic Stewardship Care-Bundle’ for automated blood culture diagnostics. J Glob Antimicrob Resist. 34, 119-126 (2023).
- Siddiqui, F., Gupta, A., Purwar, S., Saigal, S., Sharma, J. P. A prospective study to reduce turnaround time of microbiologically positive blood cultures in patients with sepsis in intensive care unit. Indian J Med Microbiol. 40 (4), 541-546 (2022).
- Gherardi, G., et al. Comparative evaluation of the Vitek-2 Compact and Phoenix systems for rapid identification and antibiotic susceptibility testing directly from blood cultures of Gram-negative and Gram-positive isolates. Diagnostic Microbiol Infect Dis. 72 (1), 20-31 (2012).
- Lemos, T. C., Cogo, L. L., Maestri, A. C., Hadad, M., Nogueira, K. d. a. S. Is it possible to perform bacterial identification and antimicrobial susceptibility testing with a positive blood culture bottle for quick diagnosis of bloodstream infections. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 51 (2), 215-218 (2018).
- Funke, G., Funke-Kissling, P. Use of the BD PHOENIX automated microbiology system for direct identification and susceptibility testing of gram-negative rods from positive blood cultures in a three-phase trial. J Clin Microbiol. 42 (4), 1466-1470 (2004).
- Nimer, N. A., Al-Saa’da, R. J., Abuelaish, O. Accuracy of the VITEK 2 system for a rapid and direct identification and susceptibility testing of Gram negative rods and Gram-positive cocci in blood samples. East Mediterr Health J. 22 (3), 193-200 (2016).
- Quesada, M. D., et al. Performance of VITEK-2 Compact and overnight MicroScan panels for direct identification and susceptibility testing of Gram-negative bacilli from positive FAN BacT/ALERT blood culture bottles. Clin Microbiol Infect. 16 (2), 137-140 (2010).
- De Cueto, M., Ceballos, E., Martinez-Martinez, L., Perea, E. J., Pascual, A. Use of positive blood cultures for direct identification and susceptibility testing with the Vitek 2 system. J Clin Microbiol. 42 (8), 3734-3738 (2004).
- Munoz-Dávila, M. J., Yagüe, G., Albert, M., García-Lucas, T. Comparative evaluation of Vitek 2 identification and susceptibility testing of Gram-negative rods directly and isolated from BacT/ALERT-positive blood culture bottles. Euro J Clin Microbiol Infect Dis. 31 (5), 663-669 (2012).
- EUCAST. Quality control criteria for the implementation of the RAST method. Version 6.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility testing. , (2023).
- Chen, J. R., Lee, S. Y., Yang, B. H., Lu, J. J. Rapid identification and susceptibility testing using the VITEK 2 system using culture fluids from positive BacT/ALERT blood cultures. J Microbiol, Immunol Infect. 41 (3), 259-264 (2008).
- Bruins, M. J., Bloembergen, P., Ruijs, G. J. H. M., Wolfhagen, M. J. H. M. Identification and susceptibility testing of Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa by direct inoculation from positive BACTEC blood culture bottles into Vitek 2. J Clin Microbiol. 42 (1), 7-11 (2004).
- Lupetti, A., Barnini, S., Castagna, B., Nibbering, P. H., Campa, M. Rapid identification and antimicrobial susceptibility testing of Gram-positive cocci in blood cultures by direct inoculation into the BD Phoenix system. Clin Microbiol Infect. 16 (7), 986-991 (2010).
- Barreales, A., Lara, M., Hernández, I., Díez, O. Rapid identification and susceptibility testing of Gram-positive cocci in BacT/ALERT blood cultures by direct inoculation into the Vitek 2 system. Rev Esp Quimioter. 24 (3), 131-135 (2011).
Tags
.