Direkte mikrobielle Identifizierung mit einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem zur Erleichterung der EUCAST RAST-Methode ohne Massenspektrometrie

Summary

EUCAST hat ein Protokoll für direkte antimikrobielle Empfindlichkeitstests (AST) für automatisierte Blutkulturen entwickelt. Die Abhängigkeit von der massenspektrometrischen mikrobiellen Identifizierung kann jedoch durch die Verwendung eines direkten Inokulumvorbereitungsprotokolls in einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem vermieden werden. Mit diesem Ansatz können AST-Berichte innerhalb von 24 Stunden nach der Probenentnahme bereitgestellt werden.

Abstract

Die gramnegative (GN) Sepsis ist ein medizinischer Notfall, bei dem sich die Behandlung in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen auf konventionelle mikrobiologische Kulturtechniken stützt, die innerhalb von 3-4 Tagen Ergebnisse liefern. In Anbetracht dieser Verzögerung in der Durchlaufzeit (TAT) haben sowohl EUCAST als auch CLSI Protokolle zur Bestimmung von AST-Ergebnissen direkt aus positiv gekennzeichneten automatisierten Blutkulturflaschen (“aBCs”) entwickelt. Das EUCAST-Schnelltestprotokoll (RAST) wurde erstmals 2018 eingeführt, wobei Zonendurchmesser-Breakpoints für vier häufige ätiologische Erreger der GN-Sepsis, d. h. Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und Acinetobacter baumannii-Komplex , berichtet werden können. Diejenigen klinischen Laboratorien, die diese Methode in ihren routinemäßigen Arbeitsablauf implementiert haben, verlassen sich jedoch auf eine massenspektrometrische mikrobielle Identifizierung, die nicht ohne weiteres verfügbar ist, was ihre Implementierung in ressourcenbegrenzten Umgebungen ausschließt. Um dies zu umgehen, evaluierten wir ein direktes Inokulumprotokoll (DIP) unter Verwendung eines kommerziellen automatisierten mikrobiellen Identifizierungs- und antimikrobiellen Empfindlichkeitstestsystems (aMIAST), um eine frühzeitige mikrobielle Identifizierung innerhalb von 8 Stunden nach positiver Markierung von aBC zu ermöglichen. Wir haben dieses Protokoll von Januar bis Oktober 2023 ausgewertet, um die vier RAST-meldepflichtigen GN (RR-GN) im positiv gekennzeichneten aBC zu identifizieren. Die Ergebnisse der mikrobiellen Identifizierung in DIP wurden mit dem Standard-Inokulumvorbereitungsprotokoll (SIP) in aMIAST verglichen. Von 204 +aBCs mit monomorphem GN (+naBC) wurde eines der 4 RR-GN in 105 +naBCs mittels SIP identifiziert (E. coli: 50, K. pneumoniae: 20, P. aeruginosa: 9 und A. baumannii-Komplex : 26). Davon wurden 94 % (98/105) korrekt durch DIP identifiziert, während die Quoten für schwerwiegende Fehler und sehr große Fehler bei 6 % (7/105) bzw. 1,7 % (4/240) lagen. Wenn DIP zur mikrobiellen Identifizierung mit der EUCAST RAST-Methode durchgeführt wird, können innerhalb von 24 Stunden nach Erhalt der Probe vorläufige klinische Berichte erstellt werden. Dieser Ansatz hat das Potenzial, die TAT signifikant zu reduzieren und so eine frühzeitige Einleitung einer geeigneten antimikrobiellen Therapie zu ermöglichen.

Introduction

Sepsis, ein wichtiges globales Gesundheitsproblem, wird als lebensbedrohliche Organdysfunktion definiert, die auf eine fehlregulierte Wirtsreaktion auf eine Infektion zurückzuführen ist. Die Global Burden of Diseases Study schätzt, dass es im Jahr 2017 weltweit 48,9 Millionen Fälle von Sepsis und 11 Millionen sepsisbedingte Todesfälle gab, was fast 20 % aller weltweiten Todesfälle ausmachte¹. Etwa 2/^{3 der} Blutbahninfektionen (BSI), die zum Tod führen, sind auf gramnegative bakterielle Erreger zurückzuführen². Die Haupttodesursachen bei gramnegativen (GN) sind Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa und Acinetobacter baumannii, die bei 33 bakteriellen Erregern rund 40 % der Fälle ausmachen².

Blutkulturen sind nach wie vor der Goldstandard für die Diagnose von BSI, und eine schnelle mikrobielle Identifizierung zusammen mit den Ergebnissen von antimikrobiellen Empfindlichkeitstests (AST) ist der Schlüssel zum Management. Es wurde geschätzt, dass die Mortalitätswahrscheinlichkeit um 9 % steigt, wenn die Verabreichung geeigneter antimikrobieller Mittel bei Sepsis³ stündlich verzögert wird. Die Durchlaufzeit (TAT) von mikrobiologisch positiven Blutkulturberichten mit AST-Ergebnissen beträgt mit den verfügbaren mikrobiologischen Werkzeugen in ressourcenbegrenzten Umgebungen, auch mit automatisierten Systemen, etwa 48-72 Stunden. Infolge dieser unterdurchschnittlichen TAT werden antimikrobielle Breitbandmittel empirisch eingesetzt, was zu dem aufkeimenden Problem der Antibiotikaresistenz (AMR) beiträgt. In Anbetracht dieser dringenden Notwendigkeit, die TAT für mikrobiologische Kulturtechniken für Sepsis zu reduzieren, gehen EUCAST und CLSI dazu über, AST direkt aus positiv gekennzeichneten Blutkulturflaschen (+aBC)^4,5 durchzuführen.

Im Jahr 2018 führte EUCAST erstmals die Rapid-AST-Methode (RAST) zur Bestimmung der AST nach der Kirby-Bauer-Scheibendiffusionsmethode bei kurzen Inkubationszeiten ein, d. h. 4 h, 6 h und 8 h, direkt ab +aBC ^6,7. Die Methode ist derzeit für die Bestimmung der AST für +aBCs validiert, die eine der 8 häufigsten Ursachen von BSI enthalten, nämlich E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa und A. baumannii-Komplex bei gramnegativen und Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, E. faecium und Streptococcus pneumoniae bei grampositiven Werten⁸. Die Breakpoints für die AST-Bestimmung in verschiedenen Zeitintervallen werden für die oben aufgeführten mikrobiellen Spezies angegeben. Daher ist vor der kategorischen Interpretation der AST-Ergebnisse eine mikrobielle Identifizierung erforderlich. Der RAST-Standard legt jedoch nicht fest, mit welcher Methode die mikrobielle Identifizierung innerhalb dieses Zeitrahmens möglich ist.

Die Mehrzahl der Studien, in denen die EUCAST-RAST-Methode in ihrem Umfeld evaluiert wurde, haben die massenspektrometrische mikrobielle Identifizierung nach kurzer Inkubation auf plattierten Medien verwendet, um Mikroorganismen zu identifizieren ^{9,10,11,12,13,14,15,16,17}. Massenspektrometrische Instrumente sind jedoch nicht weit verbreitet, insbesondere in Ländern mit niedrigem bis mittlerem Einkommen (LMICs), was den potenziellen Nutzen dieser Methode stark einschränkt. Nur wenige Studien haben über die Implementierung dieser Methode in ihren Zentren ohne Massenspektrometrie berichtet 18,19,20. Tayşi et ^al.18 berichteten über eine breite Kategorisierung der GN unter Enterobacterales, Pseudomonas und Acinetobacter spp. basierend auf der Morphologie der Gramfärbung und dem Oxidase-Test, bevor die AST-Ergebnisse interpretiert wurden. In anderen Studien dieses Zentrums, von Gupta et ^al.19 und Siddiqui et ^al.20, wurde die mikrobielle Identifizierung auf Speziesebene durchgeführt, indem ein Bakterienpellet aus dem positiv markierten Blut-Brühe-Gemisch hergestellt und mit den herkömmlichen biochemischen Tests geimpft wurde. Während Tayşi et ^al.18 sich nicht zur Genauigkeit der mikrobiellen Identifizierung mit ihrem Ansatz äußerten, berichteten Gupta et ^al.19, dass mit ihrem Ansatz in 165/176 (94%) Fällen ein RAST-meldepflichtiger gramnegativer (RR-GN), d.h. entweder von E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa und A. baumannii Komplex. Bei letzterem Ansatz erfolgte die Ablesung der RAST-Ergebnisse jedoch retrospektiv unter Verwendung von Grenzwerten mit einem Zonendurchmesser von 8 Stunden erst nach der vollständigen Inkubation der konventionellen biochemischen Ergebnisse, d. h. 18-24 Stunden nach der Inokulation, und die durchschnittliche Zeit für die Berichterstattung betrug etwa 2 Tage.

Um die TAT klinischer Berichte weiter zu reduzieren, schlagen wir eine alternative Methodik vor, die eine frühzeitige Identifizierung von GN in +aBCs mit aMIAST ermöglicht. Vor der Einführung von massenspektrometrischen mikrobiellen Identifizierungssystemen galten diese automatisierten Identifizierungssysteme als Standard für die mikrobielle Identifizierung, bei denen die Identifizierung durch kolorimetrische und/oder fluorometrische Veränderungen ermöglicht wurde, die durch Testbakterien induziert wurden, wenn sie in miniaturisierten biochemischen Tests in einer Kassette befunden und die Ergebnisse mit ihrer Isolatdatenbank abgeglichen wurden. Die durchschnittliche Zeit bis zur Identifizierung in diesen Systemen beträgt etwa 4 bis 8 Stunden, ist jedoch durch die Tatsache begrenzt, dass die Hersteller empfehlen, Mikroben über Nacht zu vermehren, bevor ihre jeweiligen Ausweise geimpft werden können. Diese Anforderung schränkt ihren Nutzen bei der Verkürzung der Zeit bis zur Berichterstellung stark ein.

Nur wenige Studien haben Methoden zur direkten Identifizierung von Mikroben aus +aBCs unter Verwendung dieser automatisierten Systeme^evaluiert 21,22,23,24,25,26,27. Im Fall von +aBCs, die monomorphe GN enthielten, zeigte die Mehrzahl der Studien eine ausgezeichnete Übereinstimmung zwischen der direkten Inokulation mit Bakterienpellets aus positivem Blut-Brühe-Gemisch und der Standard-Kolonieinkubation. Bei den Grampositiven waren die Konkordanzraten jedoch suboptimal. Da die durchschnittliche Zeit bis zur Positivität von +aBCs zwischen 8 h und 16 h liegt und die Identifizierung von GN in einem automatisierten mikrobiellen Identifizierungssystem ~4 h bis 8 h dauert, stellen wir die Hypothese auf, dass wir durch die Verwendung des direkten Inokulationsprotokolls bei der automatisierten mikrobiellen Identifizierung die klinische Befundung von +aBCs mit GN mit einem RR-GN innerhalb von 24 Stunden nach Probeneingang abschließen können.

Schauplatz für die Studie
Die vorliegende Studie wurde von Januar bis Oktober 2023 im klinischen Bakteriologielabor eines akademischen Instituts für tertiäre Versorgung von nationaler Bedeutung (INI) mit 950 Betten in Zentralindien durchgeführt. Das Labor ist mit einem kontinuierlichen Blutkulturüberwachungssystem (CBCMS) und aMIAST ausgestattet. Das bakteriologische Labor ist rund um die Uhr in Betrieb und steht Technikern und Mikrobiologen für die Bearbeitung und Meldung von positiv gekennzeichneten Blutkulturflaschen (+aBCs) zur Verfügung.

Hier eingesetzte mikrobielle Methoden
Der Arbeitsablauf der Studie ist in Abbildung 1 dargestellt. Die +aBCs, die monomorphe GNs (+naBC) zeigten, wurden durch direkte Inokulation der entsprechenden Identifikationskarten verarbeitet, um die Identifizierung und AST unter Verwendung des EUCAST-RAST-Protokolls zu ermöglichen. Diese Ergebnisse wurden mit der Standard-of-Care (SoC)-Methode für +aBCs verglichen, d.h. der Subkultivierung auf konventionellen plattierten Medien durch Schafblut-Agar (SBA), Schokoladen-Agar (CA) und MacConkey-Agar (MA), aerobe Inkubation für 16 bis 24 Stunden, gefolgt von Identifizierungs- und AST-Karten, die von aMIAST gegeben wurden, wenn isolierte Kolonien auftreten. Blutkulturen, die grampositive Kokken, grampositive Bazillen, knospende Hefezellen und ≥2 verschiedene Mikroorganismen auf der anfänglichen Grammfärbung oder plattierten Medien zeigten, wurden von der Studie ausgeschlossen.

Protocol

Die Studie, die durch das intramurale Forschungsstipendium finanziert wurde, das Dr. Ayush Gupta von AIIMS Bhopal gewährt wurde, wurde von der Institutionellen Ethikkommission für Menschen (IHEC) mit dem Schreiben Nr.: IHEC-LOP/2022/IL072 genehmigt. HINWEIS: Es wurde ein Probenvolumen von 5 ml verwendet, basierend auf Studien von Quesada et al.25 und Munoz-Davila et al.27. 1. Standard-Inokulumprotokoll (SIP) f?…

Representative Results

Allgemeine ErgebnisseWährend des Studienzeitraums wurden 240 +naBCs mittels aMIAST sowohl mit DIP als auch mit SIP identifiziert. Davon erwiesen sich 15% (36/240) +naBCs nach nächtlicher Inkubation auf den plattierten Medien als polymikrobiell. Von den 204 +naBCs betrug der Anteil der mittels SIP identifizierten RR-GN 51,5 % (105/204). Davon entfielen 47,6 % (50/105) auf E. coli, 19 % (20/105) auf K. pneumoniae, 8,6 % (9/105) auf P. aeruginosa und 24,8 % (26/105) auf …

Discussion

Mittels DIP ist es uns gelungen, die RR-GNs mit hoher diagnostischer Genauigkeit zu identifizieren. Der mittlere TTI nach positiver Markierung des aBC betrug nur 507 min (~ 8,5 h). In Verbindung mit der EUCAST-RAST-Methode zur AST-Bestimmung kann es eine Isolatidentifizierung bei einer AST-Lesezeit von 8 h ermöglichen. Dieser Ansatz hat das Potenzial, die EUCAST-RAST-Methode zu implementieren, wodurch eine massenspektrometrische Identifizierung überflüssig wird. Dies ist ein Segen für ressourcenarme Einrichtungen, di…

Materials

ANTIMICROBIAL DISKS
Amikacin disk 30 µg	Himedia, Mumbai, India	SD035-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Amoxyclav disk (20/10 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD063-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Cefotaxime disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD295E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ceftazidime disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD062A-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Ciprofloxacin disk (5 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD060-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Co-Trimoxazole disk (23.75/1.25 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD010-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Gentamicin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD016-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Imipenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD073-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Levofloxacin disk 5 µg	Himedia, Mumbai, India	SD216-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Meropenem disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD727-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Piperacillin-tazobactam disk (30/6 µg)	Himedia, Mumbai, India	SD292E-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
Tobramycin disk 10 µg	Himedia, Mumbai, India	SD044-1VL	Antimicrobial susceptibility testing
ATCC Escherichia coli 25922	Microbiologics, Minnesota USA	0335A	Recommended Gram negative bacterial strain for quality control in RAST
BacT-Alert 3D 480	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	412CM8423	Continuous automated blood culture system
Biosafety cabinet II Type A2	Dyna Filters Pvt. Limited, Pune, India	DFP-2/21-22/149	For protection against hazardous  and infectious agents and to maintain quality control
Blood agar base no. 2	Himedia, Mumbai, India	M834-500G	Preparation of blood agar and chocolate agar
Clinical Centrifuge Model SP-8BL	Laby Instruments, Ambala, India	HLL/2021-22/021	Centrifugation at low and high speed for separation of supernatant
Dispensette S Analog-adjustable bottle-top dispenser	BrandTech, Essex CT, England	V1200	Dispensing accurate amount of saline
MacConkey agar	Himedia, Mumbai, India	M008-500G	Differential media for Lactose fermenters/ non-fermenters Gram negative bacilli
Micropipette (100-1000 µL)	Axiflow Biotech Private Limited, Delhi, India	NJ478162	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Micropipette tips (200-1000 µL)	‎Tarsons Products Pvt. Ltd., Kolkata, India	521020	Transferring supernatant after first centrifugation, discarding supernatant after second centrifugation
Mueller-Hinton agar	Himedia, Mumbai, India	M173-500G	Antimicrobial susceptibility testing by Kirby-Bauer method of disk diffusion
Nichrome loop D-4	Himedia, Mumbai, India	LA019	For streaking onto culture media
Nichrome straight wire	Himedia, Mumbai, India	LA022	For stab inoculation
Nulife sterile Gloves	MRK healthcare Pvt Limited, Mumbai, India		For safety precautions
Plain vial (Vial with red top), Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367815	Obtaining pellet after second centrifugation
Sheep blood	Labline Trading Co., Hyderabad, India	70014	Preparation of blood agar and chocolate agar
SST II tube, Advance BD vacutainer	Becton-Dickinson, Cockeysville, MD, USA	367954	Supernatant separation in first centrifugation
Sterile cotton swab (w/Wooden stick)	Himedia, Mumbai, India	PW005-1X500NO	Lawn culture of blood culture broth for antimicrobial susceptibility testing
Sterile single use hypodermic syringe 5ml/cc	Nihal Healthcare, Solan, India	2213805NB2	Preparing aliquots from +aBC
VITEK DensiCHEK McFarland reference kit	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	422219	Densitometer to check the turbidity of suspension
VITEK saline solution (0.45% NaCl)	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	V1204	Adjustment of McFarland Standard turbidity
VITEK tube stand	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	533306-4 REV	Stand for proper placement of tubes before ID card inoculation
VITEK tubes	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France		Tubes for inoculum preparation
VITEK-2 Compact 60	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	VKC15144	Automated identification and AST system
VITEK-2 GN card	bioMerieux, Marcy d’ Etoille, France	21341	Identification of Gram negative bacilli