Met behulp van Laser pincet voor het manipuleren van geïsoleerde neuronen in vitro
Summary
Deze video beschrijft de manipulatie van gekweekte neuronen met behulp van laser-pincet in vitro.
Abstract
In dit artikel en video, beschrijven we de protocollen die worden gebruikt in ons laboratorium aan de doelgerichtheid voorkeuren van regenereren van celprocessen van volwassen netvlies neuronen in vitro studie. Procedures voor het bereiden van het netvlies celculturen beginnen met de dissectie, de spijsvertering en fijnwrijven van het netvlies, en eindigen met de beplating van geïsoleerde cellen op het netvlies gerechten speciaal voor gebruik met laser-pincet. Deze gerechten zijn onderverdeeld in een cel lijm half en een cel afweermiddel half. De cel klevende kant is bedekt met een laag van Sal-1-antilichamen, die een substraat waarop onze cellen groeien. Andere lijm substraten gebruikt kunnen worden voor andere celtypes. De cel afweermiddel zijde is bedekt met een dunne laag van poly-HEMA. De cellen geplateerd op de poly-HEMA kant van de schaal worden gevangen met de laser pincet, vervoerd en vervolgens naast geplaatst om een cel op het Sal-1 kant om een paar te creëren. Vorming van celgroepen van elke omvang mogelijk moet zijn met deze techniek. "Laser-pincetten gecontroleerde micromanipulatie" betekent dat de onderzoeker kan kiezen welke cellen om te bewegen, en de gewenste afstand tussen de cellen kunnen worden gestandaardiseerd. Omdat de laserstraal gaat door transparante vlakken van de cultuur schotel, zijn cel selectie en plaatsing gebeurt in een gesloten, steriele omgeving. Cellen kunnen worden gecontroleerd door video time-lapse en gebruikt worden met elke cel vereiste biologische techniek. Deze techniek kan helpen onderzoeken van cel-cel interacties.
Protocol
Discussion
Licht heeft momentum, en wanneer een lichtstraal wordt gebroken als het door een cel, een kracht nodig om de richting van het momentum te veranderen. Omwille van de wet van behoud van impuls, moet er een kracht in tegengestelde richting op zijn beurt weer reageren op een cel. Ashkin (1991) toonde aan dat de kracht die door een laserstraal gericht door een microscoop objectief zal een cel te verplaatsen naar het midden van de focus. Hoewel een laserstraal genereert slechts een paar picoNewtons van kracht, deze kracht is voldoende om een ?…
Acknowledgements
Onderzoek werd gesteund door NIH Grants EY012031 en EY0182175 en de FM Kirby Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR Scientific Inc., Westchester, PA | 48380 080 | ||
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Chemical Co., St Louis, MO | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol | |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International, Temecula CA | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use | |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | ||
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning Inc., Corning NY | 7078A-5 | ||
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning inc., Corning NY | 430165 | ||
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning Corp., Midland MI | |||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc., Albuquerque NM | |||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | |||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY | Numerical aperture (N.A. 1.3) | ||
| Black and white CCD camera | Sony Corporation, Tokyo, Japan | |||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
