本视频介绍了在体外使用激光镊子操控培养神经元的方法。
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本文内容
摘要
摘要
本文及视频中，我们描述了在体外研究成年视网膜神经元再生突起靶向偏好的实验方案。制备视网膜细胞培养物的步骤始于视网膜的解剖、消化和吹打分散，最终将分离的视网膜细胞接种于专为激光镊子实验设计的培养皿上。这些培养皿分为细胞黏附半区和细胞排斥半区。细胞黏附侧涂有一层Sal-1抗体，为细胞生长提供附着基质；其他类型的细胞可使用其他黏附基质。细胞排斥侧则涂覆一层薄薄的聚-HEMA。接种在聚-HEMA侧的细胞可被激光镊子捕获、移动，并放置于Sal-1侧的细胞旁，形成细胞配对。利用该技术，可构建任意大小的细胞群体。“激光镊子控制的微操作”意味着研究者可自主选择需移动的细胞，并能标准化细胞间的距离。由于激光束可穿透培养皿的透明表面，细胞的选择与定位均在封闭且无菌的环境中完成。细胞可通过视频延时成像进行监测，并可结合任何所需的细胞生物学技术使用。该技术可能有助于细胞间相互作用的研究。
方案
用于操控培养中分离细胞的光镊技术
光镊的捕获力源于光的动量（Ashkin, 1991；Ashkin et al., 1986）。尽管这些力能够轻松捕获悬浮状态的细胞，却无法移动已贴附于表面的细胞。因此，为了降低细胞被捕获位置处对培养皿的黏附性，需将盖玻片涂覆聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-2-hydroxyethylmethacrylate, poly-HEMA）（Sigma Chemical Co., St Louis, MO），这是一种无毒化合物，具有排斥细胞黏附的特性，此前已被用于内皮细胞黏附研究（Folkman and Moscona, 1978）。在培养皿的一半区域涂覆poly-HEMA，而另一半则涂覆支持细胞生长的基质。在本实验室中，Sal-1被用作培养蝾螈视网膜细胞的基质。以下将描述制备Sal-1和poly-HEMA包被培养皿的操作步骤：
培养皿的制备
- 用酸清洗盖玻片（#1 VWR Scientific Inc.，Media，PA）。选择此盖玻片是因为其厚度仅为0.1 mm，适用于聚焦激光所需的高数值孔径物镜。
- 为形成细胞排斥区域，将20 mg聚羟基甲基丙烯酸甲酯（poly-HEMA，Sigma Chemical Co.，St Louis，MO）溶于1 ml 95%乙醇中，在室温下静置过夜。该溶液最好在....
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讨论
光具有动量，当光束穿过细胞时发生折射，改变动量方向需要施加一个力。根据动量守恒定律，必然会产生一个方向相反的反作用力作用于细胞上。Ashkin（1991年）证明，通过显微镜物镜聚焦的激光束所产生的力可使细胞向焦点中心移动。尽管激光束仅产生几皮牛顿的力，但该力已足以在培养基中拉动细胞。为避免对细胞造成损伤，通常采用水吸收较弱的近红外波长（Liu 等，1995年）。我们实验室使用的激光镊子工作站（Cell Robotics 公司，美国新墨西哥州阿尔伯克基）采用波长为980 nm、功率为1 W的连续波二极管激光器。激光通过一个高数值孔径（N.A. 1.3）的40倍油浸平场新荧光物镜（Carl Zeiss 公司）传输至细胞，该物镜将激光束聚焦在与显微镜同一焦平面上。
与随机铺板细胞的研究相比，激光镊子控制的微操作具有多项优势。例如，可以将细胞放置在彼此之间所需的特定距离上，并且该距离可在所有被操作细胞中保持标准化。此外，激光束穿过培养皿的透明表面，因此细胞操作是在一个封闭且无菌的环境中进行的。激光产生的力非常微弱，这限制了可被捕获的对象范围。根据我们的经验，细胞黏附性和细胞形态是影响成功.......
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致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 EY012031 和 EY0182175，以及 F.M. Kirby 基金会提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 25 mm 圆形 1 号盖玻片 | VWR international | 48380 080 | |
| 聚-2-羟乙基甲基丙烯酸酯（poly-HEMA） | Sigma-Aldrich | P-3932 | 溶于 95% 乙醇 |
| 山羊抗小鼠 IgG 抗体 | Chemicon International | AP181 | 1 mg 溶于 1 ml，使用时稀释 10 倍 |
| 含小鼠抗蝾螈抗体的 Sal-1 上清液 | 由 Peter MacLeish 博士慷慨提供 | Peter MacLeish 博士，莫尔豪斯医学院，亚特兰大，佐治亚州，美国 | |
| 3 mm 内径 5 ml 吡rex 一次性移液管 | Corning | 7078A-5 | |
| 细胞培养皿 35 mm × 10 mm | Corning | 430165 | |
| Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒 | Dow Corning | ||
| 光镊-微操作工具或激光镊子 | Cell Robotics Inc. | ||
| 波长 980 nm 的 1 W 连续波二极管激光器 | Cell Robotics Inc. | ||
| Axiovert 100 倒置光学显微镜 | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 40 倍油浸 Plan-Neofluor 物镜 | Carl Zeiss, Inc. | 数值孔径（N.A. 1.3） | |
| 黑白 CCD 摄像头 | Sony Corporation | ||
| 配备软件的计算机和操纵杆 | Cell Robotics Inc. | 用于控制电动载物台 |
参考文献
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod....
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重印与许可
