Source : Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR ; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Université de Notre Dame, Indiana
Collecte de sang est une exigence commune pour les études de recherche qui impliquent des souris et des rats. La méthode de prélèvement de sang chez des rats et des souris dépend de la quantité de sang nécessaire, la fréquence de l’échantillonnage, l’état de santé de l’animal à être saigné et le niveau de compétence du technicien. 1 tous les saignements de méthodes discutées-rétro-orbitaire sinus, saignements de snip queue initiale et intracardiaque saigne-nécessite l’utilisation d’une anesthésie générale.
Avant la procédure de purge, le type d’échantillon nécessaire doit être déterminé. Il faudra effectuer des procédures expérimentales sang total, sérum ou plasma. Pour le sang total, un anticoagulant doit être ajouté à l’échantillon. Plasma, qui contient le fibrinogène et autres facteurs de coagulation lorsque séparé de globules rouges, peut être extraites d’un échantillon d’anticoagulé. Sérum est obtenu par prélèvement sanguin sans anticoagulant. Le sérum résulteront de centrifugation de l’échantillon une fois qu’un caillot s’est formé. Comme l’exemple a coagulé, le sérum ne contient pas de fibrinogène ou autres facteurs de coagulation. Sérum et le plasma sont obtenus par l’utilisation d’une centrifugeuse courue à 2200-2500 tr/min pour un minimum de 15 minutes.
Pour un exemple qui doit céder le sang total ou plasma, un anticoagulant approprié doit être utilisé. Les anticoagulants couramment utilisés pour les animaux de laboratoire sont l’héparine, citrate de sodium et l’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) ; sélection dont est issue des besoins de recherche. Séquestrer une forme liquide d’EDTA, héparine et citrate de sodium-peut être chargé directement dans la seringue pour enduire les surfaces. Cela permet le contact de l’anticoagulant directement lorsque le sang est tiré, aidant dans la prévention de la coagulation. Rat des caillots sanguins plus rapides que le sang plus chez les mammifères, il est essentiel que le bon ratio d’anticoagulant à sang soit utilisée pour la collecte de sang.
Sélection de l’aiguille est basée sur la taille de l’animal et le site de la ponction veineuse. En général, plus le diamètre de l’aiguille, plus vite l’échantillon peut être collecté. Moins de dommages pour les cellules sanguines est un autre avantage à grandes AIG. Toutefois, le principal inconvénient d’aiguilles de gros calibre est des dommages potentiels causés au navire. Sur les rats et les souris, les choix du calibre des aiguilles de calibre de 20 à 29 qui sont de 0,5 à 1,5 pouces de longueur. Si une aiguille est trop longue, non seulement est-il difficile à utiliser, mais ayant de l’espace supplémentaire dans l’aiguille pourrait entraîner la coagulation. La taille de l’aiguille appropriée est répertoriée pour chaque méthode dans la section procédures.
La taille de l’échantillon requis doit également être prédéterminée. En raison de l’exiguïté de la souris ou le rat, le montant maximal de prélèvement de sang doit être calculé pour un saignement de la survie. Une souris moyenne 25 grammes a un volume de sang total de 1,8 ml ; le rat moyen pesant 250 grammes a un volume de sang total de 16 ml. Pour obtenir un exemple simple de sang sur une souris ou un rat sans le remplacement des liquides, le volume maximal de sang qui peut être enlevé en toute sécurité est de 10 % du volume sanguin total, ou 7.7-8 µl/g. Ainsi pour une souris moyenne, 10 % de son volume sanguin est de 193-200 µl. Pour un rat moyen de 250 grammes, cela équivaut à 1,9-2,0 ml. des études ont montré que l’enlève plus de 15 % du volume sanguin peut causer un choc hypovolémique. 1, 2 , avec remplacement liquidien, jusqu’à 15 % du volume sanguin total- ou 12 µl/g-peut être supprimé. Pour une souris de 25 grammes, cela équivaut à 300 µl ; pour un rat de 250 grammes, il est équivalent à 3 ml. Pour remplacer les liquides, les liquides doivent être réchauffés et sous-cutanée.
S’il est nécessaire de prélever des échantillons multiples, réduire le volume de sang tiré. Le volume maximal de sang qui peut-être être dessiné par semaine est pas plus de 7,5 % du volume sanguin total, ou 6 µl/g. Pour une souris de 25 grammes, cela revient à 145-150 µl par semaine. Pour un rat de 250 grammes, cela revient à 1,45 à 1,50 ml par semaine. Si le prélèvement aura lieu toutes les 2 semaines, jusqu’à concurrence de 10 % du volume sanguin total (8 µl/g) peut-être être dessiné. C’est équivalent à 200 µl toutes les 2 semaines pour une souris moyenne et jusqu’à 2,00 ml toutes les 2 semaines pour un rat de 250 grammes. Une étude effectuée sur des rats avec un poids moyen de 250 grammes, a révélé que lorsque les volumes sanguins de 15 à 20 % ont été supprimés, il a fallu plus de 29 jours, pour les niveaux sanguins de normaliser. 1, 2 pour la collecte de sang répétées, remplacement liquidien ne permet pas pour un plus grand volume de sang ou de la collecte de sang plus fréquente, car il ne remplace que volume. L’animal aura besoin de temps pour reconstituer les cellules sanguines.
L’utilisation du plexus rétro-orbitaire est une pratique courante dans le passé. Cependant, beaucoup de préoccupations concernant la cruauté de cette procédure sont apparus. Au cours de la procédure, un mouvement excessif du tube hématocrite une fois placé dans le canthus médial de le œil peut endommager les tissus environnants, ce qui entraîne un gonflement des paupières et/ou des membranes conjonctivales. Les tissus enflés peuvent causer le globe oculaire saillie assez loin pour que la fermeture de la paupière est entravée, potentiellement entraînant un séchage cornéen et l’endommager. Douleur de gonflement peut déclencher des rayures et l’automutilation qui résulte en une énucléation de l’oeil. Une mauvaise mise en place du tube hématocrite au cours d’une hémorragie rétro-orbitaire peut rompre le nerf optique, entraînant la cécité. Si le tube de l’hématocrite est avancé à un mauvais angle, le œil peut être forcé hors de l’orbite, ce qui permet des paupières tomber derrière le globe oculaire. Dans ce cas, il est très difficile de remplacer correctement l’oeil dans la douille. Autres problèmes qui peuvent survenir incluent la fracturation des os fragiles orbite, pénétration du globe oculaire entraînant la perte de vitré, ou la formation d’un hématome derrière le œil qui peut se traduire par une douleur extrême en raison de la pression sur le œil et de ses environs Ouvrages d’art. Malgré tous ces soucis, si un technicien effectue la procédure et que l’animal est complètement anesthésié avec une anesthésie générale, comme l’isoflurane inhalant anesthésie, rétro-orbitaire hémorragie s’est avéré être une méthode efficace de sang collection chez les rongeurs.
La structure anatomique de la zone orbitale est différente entre la souris et le rat. La souris a la rétro-orbitaire sinus-une collection de bateaux qui créent un sinus dans la zone orbitale. Dans l’orbite de l’oeil de rat, il y a un plexus de navires qui coulent derrière cet oeil ; Toutefois, ils ne forment pas un sinus, comme dans la souris. Par conséquent, il est plus facile d’effectuer cette procédure sur des souris. Pour la collecte d’échantillonnage répété par l’intermédiaire du plexus rétro-orbitaire, un minimum de 10 jours entre saigne est nécessaire pour permettre les tissus dans la zone à guérir. Bien que l’anesthésie générale est recommandé, la procédure peut être effectuée chez les souris sans anesthésie générale si un anesthésique topique ophtalmique, tels que proparacaïne ou tétracaïne, est appliqué avant l’intervention. Comme les rats n’ont pas le sinus rétro-orbitaire, et parce que leurs membranes autour de l’orbite sont beaucoup plus forts, il est obligatoire de les anesthésier pour cette procédure.
On trouvera des échantillons de série d’un petit volume en utilisant une méthode d’attache de queue. La première amputation de la queue doit être limitée à un bout de la queue, environ 0,5 à 1,0 mm de longueur chez les souris et rats de 2,0 mm. 1 que la procédure de capture de queue pour prélèvement sanguin permet pour les collections de la série en perturbant la tavelure ou caillot de l’original coupé à l’extrémité de la queue. Amputation supplémentaire de la pointe de la queue n’est généralement pas nécessaire. Volumes de sang prélevé gamme 20-100 µL de souris et de 75-150 µL pour les rats. Le montant perçu est variable entre les animaux et peut être influencé par l’âge, l’état de santé et le poids.
L’échantillon prélevé dans un snip queue peut contenir de sang artériel et veineux, ainsi que de la contamination des tissus produits. La qualité de l’échantillon diminue si la queue est caressée ou « traites » pour obtenir plus de sang. Pour augmenter le flux sanguin, la queue peut être chauffée avec des compresses chaudes, une lampe chauffante ou l’immersion dans l’eau tiède. La pression doit être appliquée à l’extrémité de la queue pour l’hémostase, et animaux doit être vérifiée toutes les 5-10 minutes afin d’assurer l’hémostase a été atteint. Hémostase est souvent retardée avec échantillonnage répété. Une poudre styptique peut être utilisée pour l’hémostase. Pour la première amputation, anesthésie (générale ou locale) est recommandé. Saignement ultérieur ne devrait pas nécessiter l’anesthésie, autant que les animaux deviennent habitués à la procédure. L’anesthésie va causer une baisse de tension artérielle, ce qui rend difficile le prélèvement de sang avec cette technique.
Une alternative à un snip de queue est le Pseudo de navire de queue. Cette procédure est facilement réalisée sur des souris et des rats. Cependant, comme avec le snip de queue, les échantillons peuvent être contaminées avec des produits de tissus, en particulier chez la souris. Pour les rats, une aiguille hypodermique est insérée dans le vaisseau, et le sang est prélevé de la station de l’aiguille. Une étude a démontré l’utilisation d’un tourniquet placé au-dessus du site de ponction de l’aiguille afin d’aider à la collecte de sang. 3 Une seringue n’est pas utilisée pour dessiner le sang hors du récipient, comme la pression engendrée de la seringue s’effondrera le navire. Cette méthode peut aussi servir pour série d’échantillonnage, un caillot peut être enlevé pour provoquer le site de saigner à nouveau. Comme avec des cisailles de queue, il est impératif d’assurer l’hémostase en appliquant une pression sur le site et revérifier l’animal toutes les 5-10 minutes.
Souvent, les études exigent une nonsurvival, l’échantillon de sang importante qui est recueillie par exsanguination via une purge intracardiaque ou la veine cave caudale. 4 environ la moitié du volume total de sang peut être prélevée une souris ou un rat par ponction cardiaque. Cela revient à 40 µl/g ou environ 1 ml, pour une moyenne de 25 grammes de souris. Un rat de 250 grammes, produirait environ 10 ml de sang. Les animaux doivent être anesthésiés pour exsanguination. Inhalant anesthésie ou CO2 narcose peut être utilisé par un technicien compétent ; injectable anesthésie peut également être utilisé. Toutefois, il peut y avoir une diminution de la pression artérielle et la circulation, ce qui pourrait diminuer la quantité de sang prélevé.
La méthode de la veine cave caudale nécessite que l’animal être profondément anesthésiés pour exposer chirurgicalement le navire. CO2 narcose n’est pas suffisant, car le cœur doit être battu et l’animal respiratoires durant le prélèvement de sang. Au cours de la procédure, trop rapide du prélèvement de sang peut causer le navire de s’effondrer sur le biseau de la seringue, occlusion de la collection de sang ouverture et prévention. En outre, les parois des vaisseaux sont minces, et ainsi le mouvement de la main et l’aiguille doit être évité pour prévenir une rupture ou une fuite de sang provenant du site d’entrée de l’aiguille. Que l’aiguille n’est pas en passant à travers la peau, cette méthode se traduit par le prélèvement d’un échantillon stérile. Méthodes d’euthanasie appoint doivent être employés pour s’assurer que l’animal ne récupère pas d’anesthésie. Cette méthode est souvent suivie d’une perfusion cardiaque ou aortique.
La méthode intracardiaque peut être effectué soit avec l’animal immobilisé manuellement une fois que c’est anesthésié (méthode fermée), ou le cœur peut être chirurgicalement exposé conformément au protocole pour la méthode de collecte de sang veine cave caudale (méthode ouverte). Pour la méthode fermée, les points de repère pour le placement de l’aiguille sont le sillon formé par la cage thoracique au processus xiphoïde, côté gauche de l’animal.
Blood collection for mice and rats can be accomplished with a variety of techniques. Although many factors, such as sample size, frequency of sampling, and the size and age of the animal influence this, the most essential component is the skill level of the technician performing the sample collection. For the methods described here, the proper use of anesthetics is also crucial for quality samples and the wellbeing of the animals.
Blood collection is a common requirement for several research studies that involve mice and rats. The choice of method for blood withdrawal in these animals is dependent upon many factors like, the volume of blood needed, frequency of the sampling, health status of the animal to be bled, and the skill level of the technician.
Here, we will review these considerations and outline blood collection procedures including the retro-orbital eye bleed, tail snips and nicks, as well as intra-cardiac blood collection. For other methods, see the second video in this series.
Before delving into the blood withdrawal protocols, let’s first review some general considerations including sample type, needle selection, and the maximum blood volume that can be collected. Prior to collecting blood from a mouse or a rat, the type of blood sample required must be determined. Experimental procedures could require whole blood, plasma, or serum.
If collecting whole blood, an anticoagulant must be added to the sample to prevent clotting. Commonly used anticoagulants include heparin, sodium citrate, and ethylenediamine tetraacetic acid, abbreviated as EDTA. Anticoagulants can be loaded directly into the syringe to coat the surfaces. This allows contact of the anticoagulant directly as the blood is drawn aiding in the prevention of clotting. Because rodent blood clots rapidly, it is essential that the correct ratio of anticoagulant to blood be used. Plasma collection requires centrifuging the whole blood WITH anticoagulant. Following the spin, the translucent liquid above the WBC and platelet layer is plasma. It contains fibrinogen and other clotting factors. On the other hand, serum is collected from whole blood sample WITHOUT anticoagulants. And because the sample has clotted, the serum, which is the top player, does not contain fibrinogen or other clotting factors.
Needle selection is based on the size of the animal and the site of the venipuncture. In general, large bore needles cause less damage to blood cells and enable more rapid blood collection; but are more likely to cause vessel damage. Needle length should also be considered. If a needle is too long, it could be awkward to use, or blood could begin to clot while still inside the needle. The choices of size ranges from 18 to 29 gauge and 0.5 to 1.5 inches in length. The appropriate needle size for each method will be discussed in the procedures section.
Lastly, because of the small size of rodents, there is a maximum amount of blood that can be collected from a single blood draw, which will not cause serious harm to the organism. Blood withdrawal could be without or with fluid replacement – usually done using 0.9% physiological saline. The upper limit in each case is listed in the text protocol below. Furthermore, some experiments require multiple sample collection and in such cases along with fluid replacement animal will need time in between to replenish blood cells as well. Again, there is a maximum amount that can be collected during serial collection, and the upper limits are listed in the protocol below.
After reviewing some general considerations, let’s jump into the specific blood withdrawal techniques, starting with retro-orbital bleeding – a technique used by scientists to collect small volumes from the vessels near the eye. Note that the anatomical structure of the orbital area is different between the mouse and rat. The rats have a plexus of vessels that flow behind the eye, whereas the mouse has a collection of vessels that create a retro orbital sinus, which makes it is easier to perform this procedure in mice.
Begin by grabbing a tube for blood collection. Micro hematocrit tubes that hold 50-75 microliters are preferred. Lay down several paper towels or other insulating materials on the work surface. This is to maintain the animal’s body heat during the procedure. Now anesthetize the animal using an inhalation anesthetic such as isoflurane. Once the animal is fully anesthetized, remove it from the chamber and place it down on its side that is in in lateral recumbency position. Next, place a finger on the top of the head and along the jaw line and pull the skin back and down to induce eye protrusion. Avoid applying pressure to the trachea as that may cause death by asphyxia. Subsequently, place the micro-hematocrit tube in the medial canthus of the eye and direct it caudally at a 30 to 45 degree angle from the plane of the nose. Apply pressure while gently rotating the tube. This will cut through the conjunctival membranes and rupture the ocular plexus or sinus. The blood will flow into the hematocrit tube by capillary action. Avoid pushing the tube so deep that you hit the bone at the back of the ocular cavity. Once blood begins to flow, maintain pressure to keep the eye protruded. To stop bleeding, release the skin and allow the eye to return to the normal position. Apply pressure to promote hemostasis. For repeated sample collection, allow a minimum of 10 days between the bleeds. This provides tissues some time to heal.
Although retro-orbital bleeding is a common procedure, there are many concerns about its humaneness. These include swelling due to excessive movement of the hematocrit tube. This in turn can cause the eyeball protrusion and impede closure of the eyelid resulting in corneal drying, damage, and pain, which can trigger scratching and self-mutilation. Improper placement of the hematocrit tube can sever the optic nerve resulting in blindness. Another possible complication is that the eye can be forced out of the orbit, allowing the eyelids to fall behind the eyeball. Furthermore, issues can arise from the fracturing of the fragile orbit bones, penetration of the eye globe resulting in the loss of vitreous humor, or the formation of a hematoma behind the eye that can result in extreme pain. Despite all of these concerns, if a skilled technician performs the procedure and the animal is fully anesthetized, retro-orbital bleeding is an effective method of blood collection in rodents.
Now let’s review the considerations and procedures for tail bleeding, which allows collection of a serial samples of small volumes. The equipment needed for this procedure include a sterile number 11 scalpel. Scissors should not be used because the cut made by scissors is crushing, which can promote clotting and reduce blood flow. Other instruments are a restraint tube that allows access to the animal’s tail; absorbent paper towels; collection or hematocrit tubes and styptic powder – to aid in hemostasis.
Start by securing the animal into the restraint tube. Then, wipe the tail with warm water to remove debris and to cause slight vasodilation. DO NOT use hot water.Extend the tail and with the scalpel blade snip the very end of the tail to collect the blood using hematocrit or collection tubes. The tail can be stroked or “milked” from rump to tip to encourage blood flow. This will, however, decrease the quality of the sample.
To stop bleeding, apply pressure to the tail tip with a gauze pad. The styptic powder may be used to achieve hemostasis. Check the animals every 5 to 10 minutes to ensure hemostasis has been achieved, which might be delayed after repeated sampling. The sample collected from a tail snip can contain both arterial and venous blood, along with tissue product contamination. However, this procedure for blood collection allows for serial collections by disrupting the scab or clot of the original cut at the end of the tail.
An alternative blood collection method to a tail snip is the tail vessel nick, which is relatively less invasive. For this, using the same scalpel blade, make a small cut directly over the lateral tail vein, approximately two-third the distance from the rump. As with tail snips, blood can be collected in collection or hematocrit tubes. And it is imperative to assure hemostasis by applying pressure to the site and rechecking the animal every 5-10 minutes. However, as with the tail snip, the samples may be contaminated with tissue products.
Often studies that require a non-survival large blood sample, which is accomplished through exsanguination via an intra-cardiac bleed or the caudal vena cava.
For intra-cardiac method in mice, you need a 3 cc syringe with a 22 -25 gauge 1 inch needle. And for rats, a 10-12 cc syringe with an 18 gauge 1.5 inches needle is preferred. See the protocol below to understand the why these needs and syringes are ideal.
Start by euthanizing the animal using carbon dioxide. Following euthanasia, hold the rodent by the scruff with the body hanging vertically. This restrain is critical as the body should be straight to prevent deflection of the heart or a twisting of the chest. Note that the heart is located approximately at the level of the elbow. The insertion side is in the notch just to the left of the xiphoid, parallel to the spine and under the ribs.
Insert the needle, bevel up, into the chest and puncture the heart. Apply slight backpressure with the syringe. If the needle is in the heart, blood will flow into the syringe. Wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Approximately half of the total blood volume can be collected from a mouse or rat by cardiac puncture. This is equivalent to approximately 1 mL of blood from an average mouse and approximately 10 mL of blood from an average rat
An alternative position is dorsal recumbency when using the lateral approach. In this case, place the needle between the ribs on the animal’s left side. The point of entry is measured against the point of the elbow on the chest wall. Insert the needle, bevel up, perpendicular to the plane of the table at a point midway on the chest wall. Apply slight back pressure with the syringe. If the needle is in the heart blood will flow into the syringe. Again, wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Note that in either position, excessive backpressure may collapse the heart occluding the needle bevel and stopping blood flow into the syringe.
Another method to collect cardiac blood is through the caudal vena cava. The equipment needed for this procedure are an appropriate syringe with a correct size needle attached; scissors for opening the abdominal cavity, small atraumatic thumb forceps and gauze sponge. This technique requires that the animal be deeply anesthetized and maintained under anesthesia throughout the procedure. CO2 narcosis is not an option, as the animal heart must be beating for this procedure. Place the animal in dorsal recumbency position, and secure the limbs to the platform. The limbs should be extended away from the body.
Now lift the skin with forceps and use scissors to make a small transverse cut through the skin just above the pelvis in females or prepuce in males. Next, place the point of the scissors into the cut and make a midline incision through the skin from the pelvis or prepuce to the xiphoid. With the skin laterally reflected, lift the muscle and make a small transverse cut through the muscle, just above the skin cut.
Place the point of the scissor into the abdomen and make a midline incision through the muscle to the xiphoid. Be sure to angle the scissor point upward to prevent cutting any organs. Cut transversely along the curve of the ribs on each side. Be careful not to puncture the liver. Gently move the intestines to the animal’s left to expose the posterior vena cava. Place a gauze pad on the liver and rest your index and middle fingers on it. With your other hand, insert the needle, bevel up into the vena cava, midway between the junction of the renal vessels and iliac bifurcation. Slowly withdraw the blood while applying pressure on the liver.
Avoid hand movement, as that might cause the vessel rupture. Also, too rapid blood withdrawal can cause the vessel to collapse onto the bevel occluding the opening and preventing blood collection. The main advantage of this technique is the ability to collect a sterile sample because the needle does not pass through the skin.
Lastly, let’s look at some applications of these blood withdrawal techniques. Immuno-oncology is an emerging field, and researchers in this area often perform blood collection to study the immune cells at different stages of cancer development. For example, here researchers collected cardiac blood from cancer-bearing mice to isolate and quantify neutrophils at ten, twenty and thirty days following tumor engraftment.
On the other hand, blood composition is also frequently studied by physiologists. Like in this study, researchers were interested in evaluating kidney function in diabetic animals. In order to do that, these scientists first injected a dye into a diabetes animal model. Next, they then used tail snip method to collect blood at several time-points to evaluate dye concentration in blood, which was ultimately used to calculate glomerular filtration rate that highlighted the difference in kidney function following diabetes induction.
Lastly, stem cells researchers use blood samples to evaluate the success of incorporation of donor cells into the recipient’s system. Here, the investigators first transplanted bone marrow cells from a male mouse into a wild type and genetically modified female animal via the tail vein injection. Next, they collected blood from the retro orbital sinus of the recipient mouse to study the genomic DNA of blood cells using polymerase chain reaction. This provided the percentage of donor cells engraftment in the two types of animals.
You’ve just watched JoVE’s first installment on blood withdrawal techniques. Please see the next video in series to review how to perform other commonly employed techniques of blood collection in lab animals. As always, thanks for watching!
