Fuente: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidad de Notre Dame, en
Colección de la sangre es un requisito común para estudios de investigación que involucran a ratones y ratas. El método de retiro de la sangre en ratones y ratas es dependiente sobre el volumen de sangre necesitada, la frecuencia del muestreo, el estado de salud del animal para purgarse y el nivel de habilidad del técnico. 1 todos sangrados del seno discutidas retro-orbital de métodos, sangrados de snip de cola inicial y sangra intracardiaca-requieren el uso de una anestesia general.
Antes del procedimiento de purga, se determinará el tipo de muestra requerida. Procedimientos experimentales pueden requerir sangre entera, plasma o suero. Para sangre entera, debe agregarse un anticoagulante a la muestra. Plasma, que contiene fibrinógeno y otros factores de coagulación cuando se separó de los glóbulos rojos, se puede extraer de una muestra anticoagulada. Suero se obtiene a través de muestras de sangre sin anticoagulante. El suero será el resultado de la centrifugación de la muestra una vez que ha formado un coágulo. Como la muestra se haya coagulado, el suero no contiene fibrinógeno u otros factores de la coagulación. Suero y plasma se obtienen mediante el uso de una centrifugadora de ejecutar a 2200-2500 RPM durante un mínimo de 15 minutos.
Para una muestra que debe ceder sangre entera o plasma, debe usarse un anticoagulante adecuado. Anticoagulantes utilizados para animales de laboratorio son heparina, citrato de sodio y ácido de etilendiamina tetraacético (EDTA); selección de la cual se basa en las necesidades de investigación. Secuestrar una forma líquida de EDTA, heparina y citrato de sodio-puede cargarse directamente en la jeringa para recubrir las superficies. Esto permite el contacto de anticoagulante directamente como se extrae la sangre, ayudando en la prevención de la coagulación. Como coágulos de sangre de rata más rápidos que la sangre más mamífero, es esencial utilizar la proporción correcta de anticoagulante a la sangre para recolección de sangre.
Selección de la aguja se basa en el tamaño del animal y el sitio de la venopunción. En general, cuanto mayor sea el diámetro de la aguja, más rápidamente la muestra puede ser recogida. Menos daño a las células de la sangre es otro beneficio de agujas más grandes. Sin embargo, la principal desventaja para gran diámetro agujas es el daño potencial a la nave. En ratones y ratas, las opciones de la gama del tamaño de agujas de calibre 20 a 29 que son 0.5-1.5 pulgadas de longitud. Si una aguja es demasiado larga, no sólo es incómodo de usar, pero tener el espacio extra en la aguja podría resultar en coagulación. El tamaño de aguja adecuado se enumera para cada método en la sección de procedimientos.
El tamaño de la muestra requerida también debe ser predeterminado. Debido al pequeño tamaño del ratón o de rata, la cantidad máxima de colección de la sangre debe calcularse para un sangrado de supervivencia. Un ratón medio peso 25 gramos tiene un volumen total de sangre de 1,8 ml; la rata promedio de peso de 250 gramos tiene un volumen total de sangre de 16 ml. Para una muestra de sangre solo en un ratón o rata sin reposición de líquidos, el volumen máximo de sangre que se puede quitar es el 10% de la volemia total o 7.7-8 μl/g. Así para un ratón medio, 10% de su volumen de sangre es 193-200 μl. Para una rata promedio de 250 gramos, esto equivale a 1.9-2.0 ml. estudios han demostrado que la eliminación de más del 15% del volumen de la sangre puede causar shock hipovolémico. 1,2 sin embargo, con el reemplazo flúido, hasta un 15% del volumen total de sangre- o 12 μl/g-puede ser quitado. Para un ratón de 25 gramos, esto equivale a 300 μL; para una rata de 250 gramos, equivale a 3 ml. Para reposición de líquidos, los líquidos deben ser calentados y dados por vía subcutánea.
Si es necesario tomar varias muestras, se reduce el volumen de sangre dibujado. El volumen de sangre máxima que puede obtenerse por semana es no más de 7,5% el volumen total de sangre, o 6 μl/g. Para un ratón de 25 gramos, esto equivale a 145-150 μL por semana. Para una rata de 250 gramos, esto equivale a 1.45 1.50 ml por semana. Si el muestreo se producirá cada 2 semanas, se puede dibujar hasta el 10% del volumen total de sangre (8 μl/g). Esto es equivalente a 200 μL cada 2 semanas por un ratón medio y hasta 2.00 ml cada 2 semanas para una rata de 250 gramos. Un estudio realizado en ratas con el peso promedio de 250 gramos, reveló que cuando se eliminaron los volúmenes de sangre de 15-20%, le tomó más de 29 días para niveles en la sangre normalizar. 1,2 para colección de sangre repetida, reposición de líquidos no permite un mayor volumen de sangre o muestras de sangre más frecuentes, como sólo sustituye a volumen. El animal va a necesitar tiempo para reponer las células de la sangre.
El uso del plexo retro orbital ha sido una práctica común en el pasado. Sin embargo, han surgido muchas preocupaciones sobre la humanidad de este procedimiento. Durante el procedimiento, movimiento excesivo del tubo hematocrito una vez colocado en el canto medial del ojo puede causar daño a los tejidos circundantes, dando por resultado la hinchazón de los párpados o las membranas conjuntivales. Los tejidos inflamados pueden causar el globo ocular sobresale lo suficiente para que se bloqueen el cierre del párpado, potencialmente dando por resultado la sequedad corneal y el daño. Dolor de la hinchazón puede provocar arañazos y uno mismo-mutilación que provoca enucleación del ojo. Colocación inadecuada del tubo de hematocrito durante un sangrado retro orbital puede cortar el nervio óptico, resultando en ceguera. Si el tubo de hematocrito se avanza en un ángulo incorrecto, el ojo puede ser forzado fuera de la órbita, permitiendo que los párpados a caer detrás del globo ocular. Si esto ocurre, es muy difícil reemplazar correctamente el ojo en el zócalo. Otros problemas que pueden surgir incluyen fractura de los huesos frágiles de la órbita, penetración del globo ocular que resulta en la pérdida de humor vítreo, o la formación de un hematoma detrás del ojo que puede causar dolor extremo debido a la presión en el ojo y sus alrededores estructuras. A pesar de todas estas preocupaciones, si un técnico especializado realiza el procedimiento y el animal es completamente anestesiado con anestesia general, como el isoflurano inhalantes anestesia, sangrado retro orbital ha demostrado ser un método eficaz de la sangre colección en roedores.
La estructura anatómica de la zona orbital es diferente entre el ratón y la rata. El ratón tiene la retro-orbital del seno, una colección de vasos que crear un seno en la zona orbital. En la órbita del ojo de rata, hay un plexo de vasos que desembocan detrás de ese ojo; sin embargo, no forman un seno, como en el ratón. En consecuencia, es más fácil de realizar este procedimiento en ratones. Para la colección de muestreo repetitivo mediante el plexo retro orbitario, un mínimo de 10 días entre sangrados es necesaria para permitir que los tejidos de la zona a curar. Aunque se recomienda la anestesia general, el procedimiento puede realizarse en ratones sin anestesia general si se aplica un anestésico oftálmico tópico, como proparacaine o tetracaína, antes del procedimiento. Las ratas no tienen el sino de retro-orbital, y porque sus membranas alrededor de la órbita son mucho más fuertes, es obligatorio para anestesiar para este procedimiento.
Serie muestras de pequeño volumen pueden obtenerse utilizando un método de clip de cola. La primera amputación de la cola debe ser limitada a una extremidad de la cola, aproximadamente 0.5-1.0 mm de longitud en ratones y 2.0 mm en ratas. 1 que el procedimiento de recorte de cola para recolección de sangre permite colecciones serie interrumpiendo la costra o coágulo del original corte en el extremo de la cola. Por lo general, no es necesaria adicional amputación de la punta de la cola. Volúmenes de sangre recogieron gama de 20-100 μL para ratones y 75-150 μL para las ratas. La cantidad recogida es variable entre los animales y puede ser influenciada por la edad, el estado de salud y peso.
La muestra de un recorte de cola puede contener sangre arterial y venosa, con contaminación de producto tejido. La calidad de la muestra disminuye si la cola está acariciando o “ordeñada” para obtener más sangre. Para aumentar el flujo sanguíneo, la cola puede ser calentada con compresas tibias, una lámpara de calor o inmersión en agua caliente. Se aplicará presión hasta la punta de la cola para la hemostasia, y animales deben medirse cada 5-10 minutos para lograr hemostasia ha sido. Hemostasia se retrasa a menudo con muestreo repetitivo. Un polvo astringente puede usarse para la hemostasia. Para la amputación inicial, se recomienda anestesia (general o local). Sangrado posterior no requieren anestesia, sobre todo porque los animales se convierten en habituado al procedimiento. Anestesia causará una caída en la presión arterial, dificulta la recolección de sangre con esta técnica.
Una alternativa a un recorte de cola es el nick de vaso de cola. Este procedimiento se realiza fácilmente en ratones y ratas. Sin embargo, al igual que con el recorte de la cola, las muestras pueden estar contaminadas con productos de tejido, especialmente en el ratón. Para las ratas, se inserta una aguja hipodérmica en el vaso y se recoge la sangre desde el centro de la aguja. Un estudio demostró el uso de un torniquete colocado sobre el sitio de punción de la aguja para facilitar la recolección de sangre. 3 No se utiliza una jeringa para extraer la sangre fuera de la nave, como la presión generada de la jeringa derrumbará el buque. Este método también puede utilizarse para tomar muestras de la serie, como un coágulo puede ser removido para hacer el sitio a sangrar otra vez. Como con unas tijeras la cola, es imprescindible para asegurar la hemostasia aplicando presión en el sitio y segunda verificación al animal cada 5-10 minutos.
A menudo, los estudios requieren una evaluadora, muestra grande de la sangre que se recolecta a través exsanguination mediante una purga intracardiaca o la vena cava caudal. 4 aproximadamente la mitad del volumen total de sangre se puede recoger de un ratón o una rata por punción cardiaca. Esto es equivalente a 40 μl/g o 1 ml aproximadamente para un ratón de 25 gramos promedio. Una rata de 250 gramos produciría aproximadamente 10 ml de sangre. El animal debe ser anestesiado para exsanguination. Anestesia inhalante o narcosis de CO2 puede ser utilizado por un técnico competente; también puede utilizarse anestesia inyectable. Sin embargo, puede haber una disminución en la presión arterial y circulación, lo que podría disminuir la cantidad de sangre recogida.
El método de la vena cava caudal requiere que el animal se profundamente anestesiados para exponer quirúrgicamente el buque. CO2 narcosis no es suficiente, el corazón debe vencer como el animal respiración durante el retiro de la sangre. Durante el procedimiento, muy rápido de retiro de la sangre puede causar la nave a colapsar en el bisel de la jeringa, ocluir la apertura y prevención colección de sangre. Además, las paredes de los vasos son delgadas, y así movimiento de la mano y la aguja debe evitarse para prevenir ruptura o filtración de sangre desde el sitio de entrada de la aguja. Como no se que pasa la aguja por la piel, este método resulta en la colección de una muestra estéril. Métodos de eutanasia adyuvante deben emplearse para asegurar que el animal no se recupera de la anestesia. Este método es a menudo seguido de perfusión cardiaca o aórtica.
El método intracardiaco puede ser realizado con el animal restringido manualmente una vez que está anestesiado (método cerrado), o el corazón puede estar expuesto quirúrgicamente según el protocolo para el método de recogida de sangre de la vena cava caudal (método abierto). El método cerrado, los puntos de interés de colocación de la aguja son el surco formado por la caja torácica en el proceso del xiphoid, en lado izquierdo del animal.
Blood collection for mice and rats can be accomplished with a variety of techniques. Although many factors, such as sample size, frequency of sampling, and the size and age of the animal influence this, the most essential component is the skill level of the technician performing the sample collection. For the methods described here, the proper use of anesthetics is also crucial for quality samples and the wellbeing of the animals.
Blood collection is a common requirement for several research studies that involve mice and rats. The choice of method for blood withdrawal in these animals is dependent upon many factors like, the volume of blood needed, frequency of the sampling, health status of the animal to be bled, and the skill level of the technician.
Here, we will review these considerations and outline blood collection procedures including the retro-orbital eye bleed, tail snips and nicks, as well as intra-cardiac blood collection. For other methods, see the second video in this series.
Before delving into the blood withdrawal protocols, let’s first review some general considerations including sample type, needle selection, and the maximum blood volume that can be collected. Prior to collecting blood from a mouse or a rat, the type of blood sample required must be determined. Experimental procedures could require whole blood, plasma, or serum.
If collecting whole blood, an anticoagulant must be added to the sample to prevent clotting. Commonly used anticoagulants include heparin, sodium citrate, and ethylenediamine tetraacetic acid, abbreviated as EDTA. Anticoagulants can be loaded directly into the syringe to coat the surfaces. This allows contact of the anticoagulant directly as the blood is drawn aiding in the prevention of clotting. Because rodent blood clots rapidly, it is essential that the correct ratio of anticoagulant to blood be used. Plasma collection requires centrifuging the whole blood WITH anticoagulant. Following the spin, the translucent liquid above the WBC and platelet layer is plasma. It contains fibrinogen and other clotting factors. On the other hand, serum is collected from whole blood sample WITHOUT anticoagulants. And because the sample has clotted, the serum, which is the top player, does not contain fibrinogen or other clotting factors.
Needle selection is based on the size of the animal and the site of the venipuncture. In general, large bore needles cause less damage to blood cells and enable more rapid blood collection; but are more likely to cause vessel damage. Needle length should also be considered. If a needle is too long, it could be awkward to use, or blood could begin to clot while still inside the needle. The choices of size ranges from 18 to 29 gauge and 0.5 to 1.5 inches in length. The appropriate needle size for each method will be discussed in the procedures section.
Lastly, because of the small size of rodents, there is a maximum amount of blood that can be collected from a single blood draw, which will not cause serious harm to the organism. Blood withdrawal could be without or with fluid replacement – usually done using 0.9% physiological saline. The upper limit in each case is listed in the text protocol below. Furthermore, some experiments require multiple sample collection and in such cases along with fluid replacement animal will need time in between to replenish blood cells as well. Again, there is a maximum amount that can be collected during serial collection, and the upper limits are listed in the protocol below.
After reviewing some general considerations, let’s jump into the specific blood withdrawal techniques, starting with retro-orbital bleeding – a technique used by scientists to collect small volumes from the vessels near the eye. Note that the anatomical structure of the orbital area is different between the mouse and rat. The rats have a plexus of vessels that flow behind the eye, whereas the mouse has a collection of vessels that create a retro orbital sinus, which makes it is easier to perform this procedure in mice.
Begin by grabbing a tube for blood collection. Micro hematocrit tubes that hold 50-75 microliters are preferred. Lay down several paper towels or other insulating materials on the work surface. This is to maintain the animal’s body heat during the procedure. Now anesthetize the animal using an inhalation anesthetic such as isoflurane. Once the animal is fully anesthetized, remove it from the chamber and place it down on its side that is in in lateral recumbency position. Next, place a finger on the top of the head and along the jaw line and pull the skin back and down to induce eye protrusion. Avoid applying pressure to the trachea as that may cause death by asphyxia. Subsequently, place the micro-hematocrit tube in the medial canthus of the eye and direct it caudally at a 30 to 45 degree angle from the plane of the nose. Apply pressure while gently rotating the tube. This will cut through the conjunctival membranes and rupture the ocular plexus or sinus. The blood will flow into the hematocrit tube by capillary action. Avoid pushing the tube so deep that you hit the bone at the back of the ocular cavity. Once blood begins to flow, maintain pressure to keep the eye protruded. To stop bleeding, release the skin and allow the eye to return to the normal position. Apply pressure to promote hemostasis. For repeated sample collection, allow a minimum of 10 days between the bleeds. This provides tissues some time to heal.
Although retro-orbital bleeding is a common procedure, there are many concerns about its humaneness. These include swelling due to excessive movement of the hematocrit tube. This in turn can cause the eyeball protrusion and impede closure of the eyelid resulting in corneal drying, damage, and pain, which can trigger scratching and self-mutilation. Improper placement of the hematocrit tube can sever the optic nerve resulting in blindness. Another possible complication is that the eye can be forced out of the orbit, allowing the eyelids to fall behind the eyeball. Furthermore, issues can arise from the fracturing of the fragile orbit bones, penetration of the eye globe resulting in the loss of vitreous humor, or the formation of a hematoma behind the eye that can result in extreme pain. Despite all of these concerns, if a skilled technician performs the procedure and the animal is fully anesthetized, retro-orbital bleeding is an effective method of blood collection in rodents.
Now let’s review the considerations and procedures for tail bleeding, which allows collection of a serial samples of small volumes. The equipment needed for this procedure include a sterile number 11 scalpel. Scissors should not be used because the cut made by scissors is crushing, which can promote clotting and reduce blood flow. Other instruments are a restraint tube that allows access to the animal’s tail; absorbent paper towels; collection or hematocrit tubes and styptic powder – to aid in hemostasis.
Start by securing the animal into the restraint tube. Then, wipe the tail with warm water to remove debris and to cause slight vasodilation. DO NOT use hot water.Extend the tail and with the scalpel blade snip the very end of the tail to collect the blood using hematocrit or collection tubes. The tail can be stroked or “milked” from rump to tip to encourage blood flow. This will, however, decrease the quality of the sample.
To stop bleeding, apply pressure to the tail tip with a gauze pad. The styptic powder may be used to achieve hemostasis. Check the animals every 5 to 10 minutes to ensure hemostasis has been achieved, which might be delayed after repeated sampling. The sample collected from a tail snip can contain both arterial and venous blood, along with tissue product contamination. However, this procedure for blood collection allows for serial collections by disrupting the scab or clot of the original cut at the end of the tail.
An alternative blood collection method to a tail snip is the tail vessel nick, which is relatively less invasive. For this, using the same scalpel blade, make a small cut directly over the lateral tail vein, approximately two-third the distance from the rump. As with tail snips, blood can be collected in collection or hematocrit tubes. And it is imperative to assure hemostasis by applying pressure to the site and rechecking the animal every 5-10 minutes. However, as with the tail snip, the samples may be contaminated with tissue products.
Often studies that require a non-survival large blood sample, which is accomplished through exsanguination via an intra-cardiac bleed or the caudal vena cava.
For intra-cardiac method in mice, you need a 3 cc syringe with a 22 -25 gauge 1 inch needle. And for rats, a 10-12 cc syringe with an 18 gauge 1.5 inches needle is preferred. See the protocol below to understand the why these needs and syringes are ideal.
Start by euthanizing the animal using carbon dioxide. Following euthanasia, hold the rodent by the scruff with the body hanging vertically. This restrain is critical as the body should be straight to prevent deflection of the heart or a twisting of the chest. Note that the heart is located approximately at the level of the elbow. The insertion side is in the notch just to the left of the xiphoid, parallel to the spine and under the ribs.
Insert the needle, bevel up, into the chest and puncture the heart. Apply slight backpressure with the syringe. If the needle is in the heart, blood will flow into the syringe. Wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Approximately half of the total blood volume can be collected from a mouse or rat by cardiac puncture. This is equivalent to approximately 1 mL of blood from an average mouse and approximately 10 mL of blood from an average rat
An alternative position is dorsal recumbency when using the lateral approach. In this case, place the needle between the ribs on the animal’s left side. The point of entry is measured against the point of the elbow on the chest wall. Insert the needle, bevel up, perpendicular to the plane of the table at a point midway on the chest wall. Apply slight back pressure with the syringe. If the needle is in the heart blood will flow into the syringe. Again, wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Note that in either position, excessive backpressure may collapse the heart occluding the needle bevel and stopping blood flow into the syringe.
Another method to collect cardiac blood is through the caudal vena cava. The equipment needed for this procedure are an appropriate syringe with a correct size needle attached; scissors for opening the abdominal cavity, small atraumatic thumb forceps and gauze sponge. This technique requires that the animal be deeply anesthetized and maintained under anesthesia throughout the procedure. CO2 narcosis is not an option, as the animal heart must be beating for this procedure. Place the animal in dorsal recumbency position, and secure the limbs to the platform. The limbs should be extended away from the body.
Now lift the skin with forceps and use scissors to make a small transverse cut through the skin just above the pelvis in females or prepuce in males. Next, place the point of the scissors into the cut and make a midline incision through the skin from the pelvis or prepuce to the xiphoid. With the skin laterally reflected, lift the muscle and make a small transverse cut through the muscle, just above the skin cut.
Place the point of the scissor into the abdomen and make a midline incision through the muscle to the xiphoid. Be sure to angle the scissor point upward to prevent cutting any organs. Cut transversely along the curve of the ribs on each side. Be careful not to puncture the liver. Gently move the intestines to the animal’s left to expose the posterior vena cava. Place a gauze pad on the liver and rest your index and middle fingers on it. With your other hand, insert the needle, bevel up into the vena cava, midway between the junction of the renal vessels and iliac bifurcation. Slowly withdraw the blood while applying pressure on the liver.
Avoid hand movement, as that might cause the vessel rupture. Also, too rapid blood withdrawal can cause the vessel to collapse onto the bevel occluding the opening and preventing blood collection. The main advantage of this technique is the ability to collect a sterile sample because the needle does not pass through the skin.
Lastly, let’s look at some applications of these blood withdrawal techniques. Immuno-oncology is an emerging field, and researchers in this area often perform blood collection to study the immune cells at different stages of cancer development. For example, here researchers collected cardiac blood from cancer-bearing mice to isolate and quantify neutrophils at ten, twenty and thirty days following tumor engraftment.
On the other hand, blood composition is also frequently studied by physiologists. Like in this study, researchers were interested in evaluating kidney function in diabetic animals. In order to do that, these scientists first injected a dye into a diabetes animal model. Next, they then used tail snip method to collect blood at several time-points to evaluate dye concentration in blood, which was ultimately used to calculate glomerular filtration rate that highlighted the difference in kidney function following diabetes induction.
Lastly, stem cells researchers use blood samples to evaluate the success of incorporation of donor cells into the recipient’s system. Here, the investigators first transplanted bone marrow cells from a male mouse into a wild type and genetically modified female animal via the tail vein injection. Next, they collected blood from the retro orbital sinus of the recipient mouse to study the genomic DNA of blood cells using polymerase chain reaction. This provided the percentage of donor cells engraftment in the two types of animals.
You’ve just watched JoVE’s first installment on blood withdrawal techniques. Please see the next video in series to review how to perform other commonly employed techniques of blood collection in lab animals. As always, thanks for watching!
