ソース: ケイ ・ スチュワート、RLATG、RVT CMAR;ヴァレリー A. シュレーダー、RVT、RLATG。ノートルダムのノートルダム大学
採血は、マウスやラットを含む研究のための一般的な要件です。マウスおよびラットの血液回収の方法は、必要血液量、サンプリングの頻度、抽気される動物の健康状態と、技術者のスキルレベルに依存です。1すべてのメソッド説明レトロ軌道洞裁ち落とし位置、初期尻尾切り取り領域の出血、および心腔内の出血・全身麻酔の使用を必要とします。
出血の手続きの前に必要なサンプルの種類を決定する必要があります。実験手順は、全血、血漿または血清を必要があります。全血などの抗凝固剤をサンプルに追加されていなければなりません。フィブリノゲンと赤の血液細胞から分離したとき、他の凝固因子を含む血漿高血圧症サンプルから抽出できます。血清は抗凝固剤なしの血のコレクションを通じて取得されます。血栓形成後、血清サンプルの遠心からなります。サンプルはクロテッド クリームてい、フィブリノゲンあるいは他凝固因子血清は含まれません。血漿、血清は 2200-2500 RPM で 15 分の最小値を実行する遠心分離機を使用して取得されます。
全血または血漿をもたらす必要がありますサンプルでは、適切な抗凝固剤を使用する必要があります。実験動物の一般的に使用される抗凝固剤はヘパリン、クエン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA);選択は、リサーチのニーズに基づいています。EDTA、ヘパリン、クエン酸ナトリウムが液状を隔離、表面をコートする注射器に直接読み込みます。これにより、抗凝固薬の接触直接血液を描画すると、凝固の防止で助けます。ほとんどの哺乳類の血よりも高速のラット血液凝固として適切な割合の血液に抗凝固剤の血のコレクションを使用することが不可欠です。
針の選択は、動物のサイズと静脈穿刺のサイトに基づいています。一般的には、穴径が大きいほど針のより急速にサンプルが収集することができます。血液細胞以下のダメージは大きい針にもう一つの利点です。しかし、大口径針の主な欠点は、船が損傷する可能性です。マウス、ラットに 0.5 1.5 20 29 ゲージ針からサイズの範囲の選択肢インチ長さ。針が長すぎる場合だけでなく、使いにくいですが、凝固針で余分なスペースを持っている可能性があります。適切な針のサイズは、プロシージャ セクションのメソッドごとに表示されます。
必要なサンプルのサイズを事前にする必要がありますもはあります。マウスまたはラットのサイズが小さいため生存ブリードの血のコレクションの最大の量を計算する必要があります。25 グラムの重量を量る平均マウスは 1.8 ml の全血液量250 グラムの重量を量る平均ラットは 16 ml の総血液量です。マウスまたはラット水分補給せずに単一の血液サンプル、安全に削除することができます最大血液量は総血液量または 7.7 8 μ l/g の 10% です。 このように平均的なマウスの血液量の 10% は 193-200 μ l です。250 グラムの平均ラット、これは相当に 1.9 2.0 ml. 研究血液量の 15% 以上を削除乏血性ショックを引き起こすことが示されています。1, 2とエンガード、ただし、全血液量の 15% まで- または 12 μ l/g-缶が削除されます。25 グラムのマウス、これは 300 μ l; に相当250 グラムのラットを 3 ml と同じです。水分補給のため流体で暖め、注射は皮下投与します。
複数のサンプルを取るべきだ、描かれた血液量は減少します。週描画可能性があります最大の血液量は総血液量または 6 μ l/g の 7.5% です。 25 グラム マウスこれ、週 145-150 μ l に相当します。250 グラムのラットでは、この、週 1.45 1.50 ml に相当します。 2 週間毎、サンプリングが発生する総血液量 (8 μ l/g) の 10% までが描かれるかもしれません。これは 200 μ l 平均マウスに 2 週間ごとに相当、最大 2.00 ml 250 グラムのラットに 2 週間ごと。250 グラムの平均重量とラットに対して、1 つの研究では、血液量の 15-20% が削除されたときそれは血糖を正常化するため 29 日以上を取ったことを明らかにしました。1, 2繰り返し採血のため水分補給はできません血液量が多いまたはより頻繁に採血のボリュームだけ代わりになります。動物は、血液細胞を補充するための時間を必要があります。
レトロな軌道神経叢の使用は、過去に一般的な練習をされています。ただし、この手順の挫折について多くの懸念が生じています。中には、目の眼に一度置かれてヘマトクリット管の過剰な運動は、まぶたや結膜膜の腫脹をもたらす周囲の組織への損傷を引き起こす可能性が。腫れた組織眼球突出まで十分なので、まぶたの閉鎖は妨げ、角膜乾燥に至るおそれと損傷する可能性があります。腫れの痛みは、傷、自傷による眼球摘出の結果をトリガーできます。レトロな軌道出血中にヘマトクリット管の不適切な配置は、失明の生じる視神経を断ち切ることができます。ヘマトクリット管は不適切な角度で高度な目が眼球の後ろに落下するまぶたをできるように、軌道を外れて強制できます。この場合、ソケットに目を正しく交換する非常に困難です。壊れやすい軌道骨、ガラス質ユーモアの損失または目の圧力のために極度の痛みにつながる目の奥に血腫の形成の結果の眼球の浸透の破砕とその周辺に発生する他の問題が含まれて構造。すべてのこれらの懸念にもかかわらず、熟練した技術者は、手順を実行、動物イソフルレン吸入麻酔などの一般的な麻酔薬で麻酔をかけられ完全にレトロな軌道出血に示されている血の効果的な方法齧歯動物のコレクションです。
マウスとラットとの間は、軌道領域の解剖学的構造が違います。マウスには、眼窩領域の副鼻腔を作成する血管のコレクション洞、レトロな軌道があります。ネズミ目の軌道上では、その目の背後に流れる血管の神経叢です。しかし、彼らはマウスのように、副鼻腔を形成しません。したがって、マウスでこの手順を実行する方が簡単です。レトロ軌道神経叢を介して繰り返しサンプリング コレクション、最低 10 日間の出血を癒すために地区組織を許可する必要です。全身麻酔をお勧めします、プロパラカイン、テトラカインなどの局所点眼麻酔が手続きの前に適用される場合、プロシージャをマウス全身麻酔なしで実行できます。ラットは、レトロな軌道洞を持っていないと、軌道の周りの膜が非常に強いので、この手順のためそれらを麻酔する必須です。
少量のシリアルのサンプルは、尾 clip メソッドを使用して取得できます。尾の最初の切断は尻尾の先端、約 0.5 〜 1.0 mm のマウスとラットの 2.0 mm 長さに制限されなければなりません。かさぶたか元の塊を破壊してシリアル コレクション、採血の尻尾切り取り領域手順1尾の端でカットします。一般的には、尾の先端の追加の切断は必要ではありません。血液量は、20-100 μ L マウス用とラット用 75 150 μ L から範囲を収集しました。収集量は動物間の変数を年齢、健康状態、および体重の影響を受けます。
尻尾切り取り領域から採取された試料は、組織製品汚染と一緒に、動脈、静脈の血液を含めることができます。尻尾を撫でまたは「搾乳」より多くの血液を取得する場合、サンプルの質が低下します。血流を増やす、温湿布、熱ランプ、または暖かい水に浸された尾を加熱できます。止血、尾の先端に圧力を適用して、動物は、止血が達成されていることを確認するすべての 5 〜 10 分をチェック必要があります。止血が繰り返しサンプリングとよく遅れています。Styptic 粉は止血に使用可能性があります。初期の切断の麻酔 (一般的なまたはローカル) の使用をお勧めします。その後出血は必要麻酔、動物手順に慣れるように特にありません。麻酔血圧、この手法での採血が困難でドロップが発生します。
尻尾切り取り領域する代わりに、尾容器ニック。この手順を簡単にマウスとラットの両方で実行します。ただし、尻尾切り取り領域と同様、サンプルが組織製品、特にマウスと汚染されます。ラットの血管に注射針を挿入し、は採血針のハブから。1 つの研究は、直上の針穿刺血のコレクションを支援する止血帯の使用を認めた。3注射器は注射器から作成された圧力容器は崩壊するでしょう、容器から採血を使いません。このメソッドは、再び出血しサイトを引き起こす血栓を削除できるよう、シリアルのサンプリングで使用もできます。尻尾切り取り領域と同様、サイトに圧力をかけて、5-10 分ごとに動物を再確認して止血を確認することが不可欠です。
多くの場合、研究 nonsurvival、心腔内の出血または後大静脈経由で外れると出血により収集されて大規模な血液サンプルを必要とします。4約全体の血液量の半分から収集できますマウスまたはラット心臓穿刺によって。これは 40 μ l/g または平均 25 グラムのマウスの約 1 ml と同じです。250 グラムのラットでは、血液の約 10 ml をもたらすでしょう。急激な多量の麻酔動物必要があります。熟練の技術者による吸入麻酔や CO2麻酔を使用できます。注射麻酔を使用もできます。ただし、血圧や血液の量を減らすことができる循環の減少があります。
後大静脈メソッドは、動物が外科的血管を公開する深く麻酔が必要です。CO2麻酔が不十分、心する必要があり、血の撤退中に呼吸動物です。中も血撤退の急速なは遮蔽開口の予防および採血、注射器の傾斜面に崩壊する船を可能性があります。また、血管壁が薄く、破裂や針の穿刺部位からの血液の漏れを防ぐためにこのように手と針の動きを避ける必要があります。針は皮膚を通過しない、このメソッドは、滅菌サンプルのコレクションの結果します。動物が麻酔から回復しないように補助安楽死の方法を用いなければなりません。このメソッドは、多くの場合心臓や大動脈の血流が続きます。
心臓内のメソッドがすることができますそれが麻酔 (閉鎖法) は、または、中心部を手術後大静脈血コレクション法 (オープン法) のためのプロトコルに従って公開すること手動で拘束された動物のいずれかを実行します。クローズ メソッドの針の配置のランドマークまで動物の左側の剣状突起、肋骨で形成される溝です。
Blood collection for mice and rats can be accomplished with a variety of techniques. Although many factors, such as sample size, frequency of sampling, and the size and age of the animal influence this, the most essential component is the skill level of the technician performing the sample collection. For the methods described here, the proper use of anesthetics is also crucial for quality samples and the wellbeing of the animals.
Blood collection is a common requirement for several research studies that involve mice and rats. The choice of method for blood withdrawal in these animals is dependent upon many factors like, the volume of blood needed, frequency of the sampling, health status of the animal to be bled, and the skill level of the technician.
Here, we will review these considerations and outline blood collection procedures including the retro-orbital eye bleed, tail snips and nicks, as well as intra-cardiac blood collection. For other methods, see the second video in this series.
Before delving into the blood withdrawal protocols, let’s first review some general considerations including sample type, needle selection, and the maximum blood volume that can be collected. Prior to collecting blood from a mouse or a rat, the type of blood sample required must be determined. Experimental procedures could require whole blood, plasma, or serum.
If collecting whole blood, an anticoagulant must be added to the sample to prevent clotting. Commonly used anticoagulants include heparin, sodium citrate, and ethylenediamine tetraacetic acid, abbreviated as EDTA. Anticoagulants can be loaded directly into the syringe to coat the surfaces. This allows contact of the anticoagulant directly as the blood is drawn aiding in the prevention of clotting. Because rodent blood clots rapidly, it is essential that the correct ratio of anticoagulant to blood be used. Plasma collection requires centrifuging the whole blood WITH anticoagulant. Following the spin, the translucent liquid above the WBC and platelet layer is plasma. It contains fibrinogen and other clotting factors. On the other hand, serum is collected from whole blood sample WITHOUT anticoagulants. And because the sample has clotted, the serum, which is the top player, does not contain fibrinogen or other clotting factors.
Needle selection is based on the size of the animal and the site of the venipuncture. In general, large bore needles cause less damage to blood cells and enable more rapid blood collection; but are more likely to cause vessel damage. Needle length should also be considered. If a needle is too long, it could be awkward to use, or blood could begin to clot while still inside the needle. The choices of size ranges from 18 to 29 gauge and 0.5 to 1.5 inches in length. The appropriate needle size for each method will be discussed in the procedures section.
Lastly, because of the small size of rodents, there is a maximum amount of blood that can be collected from a single blood draw, which will not cause serious harm to the organism. Blood withdrawal could be without or with fluid replacement – usually done using 0.9% physiological saline. The upper limit in each case is listed in the text protocol below. Furthermore, some experiments require multiple sample collection and in such cases along with fluid replacement animal will need time in between to replenish blood cells as well. Again, there is a maximum amount that can be collected during serial collection, and the upper limits are listed in the protocol below.
After reviewing some general considerations, let’s jump into the specific blood withdrawal techniques, starting with retro-orbital bleeding – a technique used by scientists to collect small volumes from the vessels near the eye. Note that the anatomical structure of the orbital area is different between the mouse and rat. The rats have a plexus of vessels that flow behind the eye, whereas the mouse has a collection of vessels that create a retro orbital sinus, which makes it is easier to perform this procedure in mice.
Begin by grabbing a tube for blood collection. Micro hematocrit tubes that hold 50-75 microliters are preferred. Lay down several paper towels or other insulating materials on the work surface. This is to maintain the animal’s body heat during the procedure. Now anesthetize the animal using an inhalation anesthetic such as isoflurane. Once the animal is fully anesthetized, remove it from the chamber and place it down on its side that is in in lateral recumbency position. Next, place a finger on the top of the head and along the jaw line and pull the skin back and down to induce eye protrusion. Avoid applying pressure to the trachea as that may cause death by asphyxia. Subsequently, place the micro-hematocrit tube in the medial canthus of the eye and direct it caudally at a 30 to 45 degree angle from the plane of the nose. Apply pressure while gently rotating the tube. This will cut through the conjunctival membranes and rupture the ocular plexus or sinus. The blood will flow into the hematocrit tube by capillary action. Avoid pushing the tube so deep that you hit the bone at the back of the ocular cavity. Once blood begins to flow, maintain pressure to keep the eye protruded. To stop bleeding, release the skin and allow the eye to return to the normal position. Apply pressure to promote hemostasis. For repeated sample collection, allow a minimum of 10 days between the bleeds. This provides tissues some time to heal.
Although retro-orbital bleeding is a common procedure, there are many concerns about its humaneness. These include swelling due to excessive movement of the hematocrit tube. This in turn can cause the eyeball protrusion and impede closure of the eyelid resulting in corneal drying, damage, and pain, which can trigger scratching and self-mutilation. Improper placement of the hematocrit tube can sever the optic nerve resulting in blindness. Another possible complication is that the eye can be forced out of the orbit, allowing the eyelids to fall behind the eyeball. Furthermore, issues can arise from the fracturing of the fragile orbit bones, penetration of the eye globe resulting in the loss of vitreous humor, or the formation of a hematoma behind the eye that can result in extreme pain. Despite all of these concerns, if a skilled technician performs the procedure and the animal is fully anesthetized, retro-orbital bleeding is an effective method of blood collection in rodents.
Now let’s review the considerations and procedures for tail bleeding, which allows collection of a serial samples of small volumes. The equipment needed for this procedure include a sterile number 11 scalpel. Scissors should not be used because the cut made by scissors is crushing, which can promote clotting and reduce blood flow. Other instruments are a restraint tube that allows access to the animal’s tail; absorbent paper towels; collection or hematocrit tubes and styptic powder – to aid in hemostasis.
Start by securing the animal into the restraint tube. Then, wipe the tail with warm water to remove debris and to cause slight vasodilation. DO NOT use hot water.Extend the tail and with the scalpel blade snip the very end of the tail to collect the blood using hematocrit or collection tubes. The tail can be stroked or “milked” from rump to tip to encourage blood flow. This will, however, decrease the quality of the sample.
To stop bleeding, apply pressure to the tail tip with a gauze pad. The styptic powder may be used to achieve hemostasis. Check the animals every 5 to 10 minutes to ensure hemostasis has been achieved, which might be delayed after repeated sampling. The sample collected from a tail snip can contain both arterial and venous blood, along with tissue product contamination. However, this procedure for blood collection allows for serial collections by disrupting the scab or clot of the original cut at the end of the tail.
An alternative blood collection method to a tail snip is the tail vessel nick, which is relatively less invasive. For this, using the same scalpel blade, make a small cut directly over the lateral tail vein, approximately two-third the distance from the rump. As with tail snips, blood can be collected in collection or hematocrit tubes. And it is imperative to assure hemostasis by applying pressure to the site and rechecking the animal every 5-10 minutes. However, as with the tail snip, the samples may be contaminated with tissue products.
Often studies that require a non-survival large blood sample, which is accomplished through exsanguination via an intra-cardiac bleed or the caudal vena cava.
For intra-cardiac method in mice, you need a 3 cc syringe with a 22 -25 gauge 1 inch needle. And for rats, a 10-12 cc syringe with an 18 gauge 1.5 inches needle is preferred. See the protocol below to understand the why these needs and syringes are ideal.
Start by euthanizing the animal using carbon dioxide. Following euthanasia, hold the rodent by the scruff with the body hanging vertically. This restrain is critical as the body should be straight to prevent deflection of the heart or a twisting of the chest. Note that the heart is located approximately at the level of the elbow. The insertion side is in the notch just to the left of the xiphoid, parallel to the spine and under the ribs.
Insert the needle, bevel up, into the chest and puncture the heart. Apply slight backpressure with the syringe. If the needle is in the heart, blood will flow into the syringe. Wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Approximately half of the total blood volume can be collected from a mouse or rat by cardiac puncture. This is equivalent to approximately 1 mL of blood from an average mouse and approximately 10 mL of blood from an average rat
An alternative position is dorsal recumbency when using the lateral approach. In this case, place the needle between the ribs on the animal’s left side. The point of entry is measured against the point of the elbow on the chest wall. Insert the needle, bevel up, perpendicular to the plane of the table at a point midway on the chest wall. Apply slight back pressure with the syringe. If the needle is in the heart blood will flow into the syringe. Again, wait until the blood has filled the barrel before adding additional backpressure. Note that in either position, excessive backpressure may collapse the heart occluding the needle bevel and stopping blood flow into the syringe.
Another method to collect cardiac blood is through the caudal vena cava. The equipment needed for this procedure are an appropriate syringe with a correct size needle attached; scissors for opening the abdominal cavity, small atraumatic thumb forceps and gauze sponge. This technique requires that the animal be deeply anesthetized and maintained under anesthesia throughout the procedure. CO2 narcosis is not an option, as the animal heart must be beating for this procedure. Place the animal in dorsal recumbency position, and secure the limbs to the platform. The limbs should be extended away from the body.
Now lift the skin with forceps and use scissors to make a small transverse cut through the skin just above the pelvis in females or prepuce in males. Next, place the point of the scissors into the cut and make a midline incision through the skin from the pelvis or prepuce to the xiphoid. With the skin laterally reflected, lift the muscle and make a small transverse cut through the muscle, just above the skin cut.
Place the point of the scissor into the abdomen and make a midline incision through the muscle to the xiphoid. Be sure to angle the scissor point upward to prevent cutting any organs. Cut transversely along the curve of the ribs on each side. Be careful not to puncture the liver. Gently move the intestines to the animal’s left to expose the posterior vena cava. Place a gauze pad on the liver and rest your index and middle fingers on it. With your other hand, insert the needle, bevel up into the vena cava, midway between the junction of the renal vessels and iliac bifurcation. Slowly withdraw the blood while applying pressure on the liver.
Avoid hand movement, as that might cause the vessel rupture. Also, too rapid blood withdrawal can cause the vessel to collapse onto the bevel occluding the opening and preventing blood collection. The main advantage of this technique is the ability to collect a sterile sample because the needle does not pass through the skin.
Lastly, let’s look at some applications of these blood withdrawal techniques. Immuno-oncology is an emerging field, and researchers in this area often perform blood collection to study the immune cells at different stages of cancer development. For example, here researchers collected cardiac blood from cancer-bearing mice to isolate and quantify neutrophils at ten, twenty and thirty days following tumor engraftment.
On the other hand, blood composition is also frequently studied by physiologists. Like in this study, researchers were interested in evaluating kidney function in diabetic animals. In order to do that, these scientists first injected a dye into a diabetes animal model. Next, they then used tail snip method to collect blood at several time-points to evaluate dye concentration in blood, which was ultimately used to calculate glomerular filtration rate that highlighted the difference in kidney function following diabetes induction.
Lastly, stem cells researchers use blood samples to evaluate the success of incorporation of donor cells into the recipient’s system. Here, the investigators first transplanted bone marrow cells from a male mouse into a wild type and genetically modified female animal via the tail vein injection. Next, they collected blood from the retro orbital sinus of the recipient mouse to study the genomic DNA of blood cells using polymerase chain reaction. This provided the percentage of donor cells engraftment in the two types of animals.
You’ve just watched JoVE’s first installment on blood withdrawal techniques. Please see the next video in series to review how to perform other commonly employed techniques of blood collection in lab animals. As always, thanks for watching!
