HC11 lactogênica diferenciação pode ser caracterizada pela formação de estruturas de cúpula referido como mammospheres. As estruturas podem ser enumerados por microscopia de contraste de fase para ajudar a quantificar a diferenciação lactogênese.
Abstract
Uma medida fenotípicas comumente usado para determinar o grau de diferenciação do mouse em lactogênica mamárias culturas de células epiteliais é a formação de estruturas celulares em forma de cúpula referido como mammospheres<sup> 1</sup>. A linhagem de células HC11 tem sido empregado como um sistema modelo para o estudo da regulação da diferenciação lactogênica mamárias tanto<em> In vitro</em> E<em> In vivo</em<sup> 2</sup>. O HC11 células se diferenciam e sintetizar proteínas do leite em resposta ao tratamento com hormônios lactogênese. Acompanhando o crescimento do HC11 rato células epiteliais mamárias de confluência, a diferenciação lactogênica foi induzida pela adição de uma combinação de hormônios lactogênica incluindo a dexametasona, insulina e prolactina, conhecido como DIP. O HC11 células induzidas para diferenciar foram fotografados em momentos até 120 horas após a indução de diferenciação e do número de mammospheres que apareciam em cada cultura foi enumerada. O tamanho da mammospheres indivíduo se correlaciona com o grau de diferenciação e este é representado nas imagens das células de diferenciação.
Protocol
O HC11 células foram cultivadas a confluência de seis dias em meio RPMI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10%, insulina 5μg/ml, 10 mM HEPES, fator de crescimento 10ng/ml epidérmico (EGF) para estabelecer competência. As células foram lavadas com PBS e mantidos em meio de crescimento sem EGF por 24 horas. Para induzir a diferenciação lactogênica as células foram incubadas em meios de diferenciação, isto é, RPMI com dexametasona (10 -6 M), a insulina (5 mg / ml) e prolactina (5 mg / ml)…
Discussion
Para que esta técnica seja bem sucedida e da melhor qualidade, as células epiteliais deve ser mantida a confluência antes de ser induzidos com hormônios lactogênese. Pode haver situações em que há mammospheres numerosas, o que torna a quantificação difícil. Assim, para fins quantitativos, é melhor para fotografar a mammospheres em um ponto de tempo quando o número de mammospheres é capaz de ser contado.
Embora existam diversos marcadores moleculares utilizados para determinar o…
Acknowledgements
Dirigido pelo Congresso de fundos Medical Research Fund subvenção (DAMD17-01-0264) para ML Cutler e Militar dos Estados Unidos Cancer Institute para ML Cutler apoiou o trabalho.
Morrison, B., Cutler, M. L. Mouse Mammary Epithelial Cells form Mammospheres During Lactogenic Differentiation. J. Vis. Exp. (32), e1265, doi:10.3791/1265 (2009).