Het beoordelen van twee-dimensionale Kristallisatie Trials van kleine membraaneiwitten voor Structurele Biologie Studies van Electron Kristallografie
Summary
Evaluatie van twee-dimensionale (2D) kristallisatie onderzoeken voor de vorming van de bestelde membraaneiwit arrays is een zeer kritische en moeilijke taak in elektron kristallografie. Hier beschrijven we onze aanpak in het screenen en identificeren van 2D-kristallen van overwegend kleine membraaneiwitten in de range van 15 – 90kDa.
Abstract
Electron kristallografie heeft zich ontwikkeld als een methode die kan als alternatief of in combinatie met een drie-dimensionale kristallisatie en X-ray kristallografie om structuur-functie vragen van membraaneiwitten, evenals oplosbare eiwitten studie worden gebruikt. Screening voor twee-dimensionale (2D) kristallen door transmissie elektronenmicroscopie (EM) is de belangrijkste stap in het vinden van, het optimaliseren, en het selecteren van monsters voor hoge-resolutie de gegevensverzameling door de cryo-EM. Hier beschrijven we de fundamentele stappen in het identificeren van zowel grote en beval, evenals kleine 2D-arrays, dat kritieke informatie kan mogelijk leveren voor de optimalisatie van kristallisatie omstandigheden.
Door te werken met verschillende vergrotingen op de EM, worden gegevens over een reeks van kritische parameters verkregen. Lagere vergroting levert waardevolle gegevens op de morfologie en de membraan grootte. Bij hogere vergrotingen, zijn mogelijk orde en 2D-kristallen afmetingen bepaald. In dit kader wordt beschreven hoe de CCD-camera's en de online-Fourier transformaties worden gebruikt bij hogere vergrotingen te proteoliposomen voor orde en grootte te beoordelen.
Terwijl de 2D-kristallen van membraaneiwitten worden meestal geteeld door reconstitutie door middel van dialyse, de screening techniek is evenzeer van toepassing is voor de kristallen geproduceerd met behulp van monolagen, inheemse 2D-kristallen, en bestelde arrays van oplosbare eiwitten. Daarnaast is de hier beschreven methoden zijn van toepassing op de screening voor 2D kristallen van nog kleinere en grotere membraaneiwitten, waar kleinere eiwitten dezelfde hoeveelheid zorg nodig hebben in de identificatie als onze voorbeelden en het rooster van grotere eiwitten zouden meer herkenbaar worden in eerdere stadia van de screening.
Protocol
Discussion
Goede evaluatie van monsters vereist een zorgvuldige evaluatie van een voldoende aantal van membranen. Bijvoorbeeld, monsters met zo laag als 2% kristallijn arrays uit van meer dan 180 afgebeeld proteoliposomen gaf essentiële informatie voor een snelle optimalisatie van de 2D-kristallisatie voorwaarden 7.
Als neerslag van het eiwit optreedt, kan een rooster worden afgezien van verdere screening na de inspectie bij een lage vergroting, hoewel af en toe een gedeeltelijke neerslag v…
Acknowledgements
Wij danken onze medewerkers voor het leveren van waardevolle eiwitten monsters, die hebben bijgedragen tot een aantal van onze methodes met betrekking ervaring en observaties. Günther Schmalzing vriendelijk de gelegenheid om FR om dit project aan te sluiten. Barbara Armbruster, Jacob Brink en Deryck Mills worden bedankt voor hun uitstekende hulp en inbreng van de apparatuur. De financiering werd verstrekt door NIH subsidie HL090630.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | ||||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | |||
| Micropipette and pipette tips | ||||
| Whatman #4 filter paper | ||||
| 1% uranyl acetate | ||||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | ||||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | |||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
Referenzen
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
