הערכת דו מימדי ניסויים התגבשות של חלבונים בממברנה קטנים ללימודי לביולוגיה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה אלקטרונים
Summary
הערכת דו ממדי (2D) ניסויים התגבשות להקמת מערכי חלבון הורה הממברנה היא משימה קריטית מאוד קשה קריסטלוגרפיה אלקטרונים. כאן אנו מתארים את הגישה שלנו ההקרנה וזיהוי 2D גבישים של חלבונים בממברנה קטן בעיקר בטווח של 15 – 90kDa.
Abstract
קריסטלוגרפיה אלקטרונים התפתח כשיטה שניתן להשתמש בהם או לחילופין או בשילוב עם התגבשות תלת ממדי ו-X-ray קריסטלוגרפיה ללמוד מבנה שאלות פונקציה של חלבונים בממברנה, כמו גם חלבונים מסיסים. הקרנת עבור דו ממדי (2D) גבישים על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים (EM) הוא שלב קריטי למציאת, אופטימיזציה, ובחירת דוגמאות לאיסוף נתונים ברזולוציה גבוהה על ידי cryo-EM. כאן אנו מתארים את הפעולות הבסיסיות בזיהוי הן גדולות והורה, וכן מערכי 2D קטנים, שעלולים לספק מידע קריטי עבור אופטימיזציה של תנאי התגבשות.
על ידי עבודה עם בהגדלה שונים EM, נתונים על מגוון של פרמטרים קריטיים מתקבל. הגדלה תחתון מספקת נתונים חשובים על גודל המורפולוגיה הממברנה. בהגדלה גבוהה, ניתן להזמין 2D ממדים קריסטל נחושים. בהקשר זה, הוא תיאר כיצד מצלמות CCD ו-פורייה באינטרנט הופך משמשים בהגדלה גבוהה יותר כדי להעריך proteoliposomes לסדר גודל.
בעוד 2D גבישים של חלבונים בממברנה גדלים בדרך כלל על ידי הכינון מחדש על ידי דיאליזה, הטכניקה ההקרנה הוא ישים באותה מידה עבור גבישים המיוצר בעזרת monolayers, קריסטלים 2D הילידים, והורה מערכים של חלבונים מסיסים. בנוסף, בשיטות המתוארות כאן החלות על ההקרנה עבור 2D של גבישים קטנים עוד יותר, כמו גם חלבונים בממברנה גדול, שבו חלבונים קטנים דורשים את אותה כמות של טיפול זיהוי כדוגמאות שלנו הסריג של חלבונים גדול יכול להיות בקלות רבה יותר לזיהוי בשלבים קודמות של ההקרנה.
Protocol
Discussion
הערכה נכונה של דגימות דורש הערכה זהירה של מספר מספיק של ממברנות. לדוגמה, עם דגימות נמוך כמו 2% מערכי גבישי מתוך מעל 180 proteoliposomes הדמיה מסר מידע קריטי עבור אופטימיזציה מהירה של התגבשות התנאים 2D 7.
כאשר משקעים של החלבון מתרחשת, רש?…
Acknowledgements
אנו מודים משתפי הפעולה שלנו לספק דגימות חלבון בעל ערך, אשר תרמו חלק מניסיוננו שיטות ותצפיות בנושא. גינטר Schmalzing חביב סיפק את ההזדמנות FR להצטרף לפרויקט. ברברה Armbruster, יעקב ברינק ו Deryck מילס הם הודו על העזרה מצטיינים שלהם קלט על ציוד. המימון ניתן על ידי NIH מענק HL090630.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | ||||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | |||
| Micropipette and pipette tips | ||||
| Whatman #4 filter paper | ||||
| 1% uranyl acetate | ||||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | ||||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | |||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
Referenzen
- Johansen, B. V. Bright field electron microscopy of biological specimens V. A low dose pre-irradiation procedure reducing beam damage. Micron. 7, 145-156 (1976).
- Schmidt-Krey, I. Electron crystallography of membrane proteins: Two-dimensional crystallization and screening by electron microscopy. Methods. 41, 417-426 (2007).
- Wang, D. N., Kühlbrandt, W. High-resolution electron crystallography of light-harvesting chlorophyll a/b-protein complex in three different media. J Mol Biol. 217, 691-699 (1991).
- Schmidt-Krey, I., Rubinstein, J. L. Electron cryomicroscopy of membrane proteins: specimen preparation for two-dimensional crystals and single particles. Micron. , (2010).
- Schmidt-Krey, I., Mutucumarana, V., Haase, W., Stafford, D. W., Kühlbrandt, W. Two-dimensional crystallization of human vitamin K-dependent γ-glutamyl carboxylase. J Struct Biol. 157, 437-442 (2007).
- Trachtenberg, S., DeRosier, D. J., Zemlin, F., Beckmann, E. Non-helical perturbations of the flagellar filament: Salmonella typhimurium SJW117 at 9.6 Å resolution. J Mol Biol. 276, 759-773 (1998).
- Zhao, G., Johnson, M. C., Schnell, J. R., Kanaoka, Y., Irikura, D., Lam, B. K., Austen, K. F., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization conditions of human leukotriene C4 synthase requiring a particularly large combination of specific parameters. J Struct Biol. 169, 450-454 (2010).
- Cheng, A., Leung, A., Fellmann, D., Quispe, J., Suloway, C., Pulokas, J., Abeyrathne, P. D., Lam, J. S., Carragher, B., Potter, C. S. Towards automated screening of two-dimensional crystals. J Struct Biol. 160, 324-331 (2007).
- Vink, M., Derr, K. D., Love, J., Stokes, D. L., Ubarretxena-Belandia, I. A high-throughput strategy to screen 2D crystallization trials of membrane proteins. J Struct Biol. 160, 295-304 (2007).
