Avaliar Trials bidimensional cristalização de proteínas da membrana Pequenas de Estudos Biologia Estrutural por Cristalografia Electron
Summary
Avaliação bidimensional ensaios (2D) de cristalização para a formação de matrizes de proteína de membrana ordenado é uma tarefa altamente crítico e difícil em cristalografia de elétrons. Aqui, descrevemos a nossa abordagem na triagem para identificação de cristais e 2D de proteínas da membrana predominantemente de pequena faixa de 15 – 90 kDa.
Abstract
Cristalografia eletrônica tem evoluído como um método que pode ser usado tanto em alternativa ou em combinação com tridimensional cristalização e cristalografia de raios X para estudar estrutura-função perguntas de proteínas da membrana, bem como proteínas solúveis. Triagem para duas dimensões (2D) cristais por microscopia eletrônica de transmissão (EM) é o passo fundamental na busca, otimização e seleção de amostras de alta resolução de coleta de dados por crio-EM. Aqui, descrevemos as etapas fundamentais na identificação de grandes e ordenada, bem como pequenos arrays 2D, que pode potencialmente fornecer informações críticas para a otimização das condições de cristalização.
Ao trabalhar com diferentes ampliações no EM, os dados sobre uma série de parâmetros críticos é obtido. Menor ampliação fornece dados valiosos sobre o tamanho e morfologia de membrana. Em ampliações maiores, as dimensões de cristal possível fim e 2D são determinados. Neste contexto, é descrito como câmeras CCD e online-Transformações de Fourier são usados em ampliações maiores para avaliar proteoliposomes para a ordem e tamanho.
Apesar de os cristais 2D de proteínas da membrana são mais comumente cultivada por reconstituição por diálise, a técnica de rastreio é igualmente aplicável para cristais produzidos com a ajuda de monocamadas, nativo cristais 2D, e ordenou matrizes de proteínas solúveis. Além disso, os métodos aqui descritos são aplicáveis à triagem para cristais de 2D ainda menor, bem como proteínas de membrana maior, onde as proteínas menores requerem a mesma quantidade de cuidado na identificação como nossos exemplos ea rede de proteínas maiores podem ser mais facilmente identificáveis em fases anteriores do exame.
Protocol
Discussion
Avaliação adequada de amostras requer uma avaliação cuidadosa de um número suficiente de membranas. Por exemplo, amostras com tão baixo como 2% matrizes cristalinas de mais de 180 proteoliposomes imaged deu informações importantes para a otimização rápida de condições de cristalização 2D 7.
Quando a precipitação da proteína ocorre, uma grade pode ser abandonado de rastreio mais após a inspeção com pequeno aumento, embora a precipitação parcial ocasional de p…
Acknowledgements
Agradecemos aos nossos colaboradores para fornecer amostras de proteínas valiosas, que contribuíram para algumas das nossas experiências e observações métodos relacionados. Günther Schmalzing gentilmente cedido a oportunidade de FR para participar deste projeto. Barbara Armbruster, Jacob Brink e Deryck Mills são agradecidos por sua ajuda em circulação e de entrada no equipamento. O financiamento foi fornecido pelo NIH conceder HL090630.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 400-mesh copper TEM grids coated with carbon film | ||||
| forceps: regular and anti-capillary | Dumont #5 and Dumont N5AC or similar | |||
| Micropipette and pipette tips | ||||
| Whatman #4 filter paper | ||||
| 1% uranyl acetate | ||||
| Dialysis sample to be screened for 2D crystals | ||||
| Glycerol/sucrose-free dialysis buffer | Optional | |||
| JEOL-1400 transmission electron microscope (TEM) | similar 80 – 120kV TEM equipped with an Lab6 or tungsten filament and film and/or CCD cameras (Gatan Orius SC1000 and/or UltraScan1000 CCD cameras and Gatan Digitial Micrograph software package or Tietz cameras (TVIPS)) |
Referenzen
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