Tot vaststelling van primaire Adult Fibroblast Culturen van knaagdieren
Summary
Dit artikel beschrijft een protocol voor de isolatie en het onderhoud van de primaire fibroblast culturen van de huid en longweefsel van wilde knaagdieren.
Abstract
Het belang van het gebruik van primaire cellen, in plaats van kanker cellijnen, voor biologisch onderzoek wordt steeds alom erkend. Primaire cellen hebben de voorkeur in studies van de controle van de celcyclus, apoptose, en DNA-herstel, zoals kankercellen te voeren mutaties in genen die betrokken zijn bij deze processen. Primaire cellen kunnen niet voor onbepaalde tijd als gevolg van het ontstaan van replicatieve veroudering of aneuploidization worden gekweekt. Vandaar, nieuwe culturen moeten regelmatig worden vastgesteld. De procedure voor het isoleren van embryonale fibroblasten knaagdier is goed ingeburgerd, maar het isoleren van volwassen fibroblast culturen vaak een uitdaging. Volwassen knaagdieren fibroblasten geïsoleerd van muismodellen van de menselijke ziekte kan een voorkeur controle zijn wanneer ze te vergelijken met fibroblasten van menselijke patiënten. Bovendien, volwassen fibroblasten zijn de enige beschikbare materiaal bij het werken met wilde knaagdieren, waar zwangere vrouwen niet gemakkelijk kan worden verkregen. Hier hebben we een protocol voor het kweken van volwassen fibroblasten uit knaagdier huid en longen. We gebruikten deze procedure met succes te fibroblasten isoleren van meer dan twintig soorten knaagdieren van laboratorium muizen en ratten aan wilde knaagdieren zoals bever, stekelvarken, en eekhoorn.
Protocol
Discussion
Normale primaire fibroblasten bieden een uitstekend alternatief voor gevestigde kanker cellijnen in biologisch onderzoek. Een belangrijk voordeel van fibroblasten is dat ze niet te voeren mutaties in oncogenen en tumor onderdrukkers en onderhouden van intacte cel-cyclus controleposten. Dit maakt normale fibroblasten een voorkeur voor de studies van de celcyclus, DNA reparatie, en apoptose. De hier beschreven protocol voorziet in een eenvoudig recept voor de isolatie en het onderhoud van de primaire fibroblasten. Dit pro…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Steven Austad voor het verstrekken van ons met de eerste versie van dit protocol. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH en de Ellison Medical Foundation om VG en AS
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM/F12 media | Invitrogen | 11330-032 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified | Invitrogen | 01437-036 | The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts. | |
| Antibiotic/Antimycotic | Invitrogen | 15420-096 | ||
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Liberase TM Research Grade | Roche | 05401127001 | Replacement enzyme. | |
| A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 – 10 mg, Cat. no. 05401127001 – 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues. | ||||
| EMEM media | ATCC | 30-203 | The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate. | |
| Feathered #21 disposable, sterile scalpel | Multiple suppliers | |||
| Three Gas Control incubator | Forma or Heraeus |
Referenzen
- Seluanov, A. Distinct tumor suppressor mechanisms evolve in rodent species that differ in size and lifespan. Aging . Cell. 7, 813-823 (2008).
- Parrinello, S. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5, 741-747 (2003).
