El establecimiento de cultivos primarios de fibroblastos de adultos de los roedores

Summary

En este artículo se describe un protocolo para el aislamiento y mantenimiento de cultivos primarios de fibroblastos de la piel y el tejido pulmonar de los roedores salvajes.

Abstract

La importancia del uso de células primarias, en lugar de líneas celulares de cáncer, para estudios biológicos está siendo ampliamente reconocido. Las células primarias son las preferidas en los estudios de control del ciclo celular, la apoptosis y la reparación del ADN, las células cancerosas son portadores de mutaciones en los genes implicados en estos procesos. Las células primarias no pueden ser cultivadas indefinidamente debido a la aparición de la senescencia replicativa o aneuploidization. Por lo tanto, de nuevas culturas es necesario establecer con regularidad. El procedimiento para el aislamiento de los fibroblastos embrionarios de roedores está bien establecido, pero aislando las culturas de fibroblastos adultos a menudo se presenta un desafío. Fibroblastos de roedores adultos aislados de los modelos de ratón de la enfermedad humana puede ser un control preferido cuando se los compara con los fibroblastos procedentes de pacientes humanos. Además, los fibroblastos adultos son el único material disponible cuando se trabaja con roedores salvajes donde las mujeres embarazadas no pueden ser obtenidos fácilmente. Aquí les ofrecemos un protocolo para el aislamiento y cultivo de fibroblastos de la piel de roedores adultos y los pulmones. Hemos utilizado con éxito este procedimiento para aislar los fibroblastos de más de veinte especies de roedores de los ratones y ratas de laboratorio a los roedores salvajes como los castores, puerco espín, y la ardilla.

Protocol

1. Antes de empezar Esterilizar tijeras y pinzas con etanol al 70%. Lugar pequeño agitador magnético dentro de un vaso de precipitados de 30 ml, cubierta con dos capas de papel de aluminio, y autoclave. Prepare un 28 unidades Wunsch / ml de solución stock de Liberase Blendzyme 3 en agua estéril. Hacer alícuotas de 0,5 ml y congelar a -20 ° C. Descongelar una alícuota de nuevo antes de cada uso. La solución puede aparecer turbia después de la descongelación. Vortex la solución ha…

Discussion

Normal de los fibroblastos primarios ofrecen una excelente alternativa para establecer líneas celulares de cáncer en la investigación biológica. Una ventaja importante de los fibroblastos, es que no son portadores de mutaciones en oncogenes y los supresores de tumores y mantener intactos los puestos de control del ciclo celular. Esto hace que los fibroblastos normales de un sistema preferido para los estudios de la regulación del ciclo celular, reparación del ADN y la apoptosis. El protocolo aquí descrito proporc…

Materials

Material Name	Typ	Company	Catalogue Number	Comment
DMEM/F12 media		Invitrogen	11330-032
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified		Invitrogen	01437-036	The Qualified serum had been pre-tested to provide good growth support for primary fibroblasts.
Antibiotic/Antimycotic		Invitrogen	15420-096
Penicillin/Streptomycin		Invitrogen	15140-122
Liberase TM Research Grade		Roche	05401127001	Replacement enzyme.
				A note from the authors: Since Roche discontinued Liberase Blendzyme 3 (11814184001), they recommend using Liberase TM Research Grade medium Thermolysin (Cat. no. 05401119001 – 10 mg, Cat. no. 05401127001 – 100mg) instead. We have switched to this enzyme successfully with no issues.
EMEM media		ATCC	30-203	The EMEM media from ATCC already contains nonessential amino acids and sodium pyruvate.
Feathered #21 disposable, sterile scalpel		Multiple suppliers
Three Gas Control incubator		Forma or Heraeus