Vibratome Seccionamento de Preservação melhorada da citoarquitetura do Órgão de Corti de mamíferos
Summary
Um procedimento simples de vibratome seccionando o órgão de Corti, seguido por microscopia confocal e imuno-histoquímica é descrito. Este procedimento permite uma melhor preservação da citoarquitetura fino do órgão de Corti de mamíferos e, conseqüentemente, permite a quantificação precisa dos tipos de células.
Abstract
O órgão de mamíferos de Corti é um mosaico altamente ordenada celular de cabelo e não-sensorial mecanosensorial células de suporte
(Revisto em 1,2). Visualização deste mosaico celulares freqüentemente requer que o órgão de Corti é transversa. Em particular, o pilar não-sensorial e células Deiters ', cujos núcleos estão localizados basally com relação às células ciliadas, não pode ser visualizada sem cross-seccionando o órgão de Corti. No entanto, a citoarquitetura delicada do órgão de Corti de mamíferos, incluindo os processos de multa citoplasmática do pilar e células Deiters ', é difícil de preservar pela rotina de procedimentos histológicos, tais como parafina e crio-seccionamento, que são compatíveis com as técnicas de coloração imuno-histoquímica.
Aqui eu descrevo um procedimento simples e robusta consistindo de vibratome seccionamento da cóclea, coloração imuno-histoquímica destas seções vibratome no monte todo, seguido por microscopia confocal. Este procedimento tem sido utilizado amplamente para a análise immunhistochemical de múltiplos órgãos, incluindo o broto de membro mouse, gut zebrafish, fígado, pâncreas e coração (ver 3-6 para exemplos seleccionados). Além disso, este procedimento foi bem sucedida para ambos imagem e quantitificaton do número de células em órgãos pilar mutante e controle de Corti em ambos os embriões e camundongos adultos 7. Este método, no entanto, atualmente não é amplamente usado para examinar o órgão de mamíferos de Corti. O potencial para este procedimento para tanto proporcionar a preservação do maior bem citoarquitetura do órgão de Corti e adultos permitem a quantificação de vários tipos celulares é descrito.
Protocol
Discussion
O procedimento de corte vibratome, seguido por imagem imunohistoquímica e confocal permite a visualização do órgão de Corti com dano tecidual mínimo. Claramente, as imagens tiradas de confocal regiões do interior da seção vibratome mostram excelente preservação da morfologia celular, que é limitada apenas por artefatos de fixação. Confocal imagens tomadas perto das duas superfícies de corte de uma seção vibratome são muitas vezes indistinguíveis a partir de imagens de regiões internas, embora ocasion…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O autor gostaria de reconhecer o uso de Investigação de Crianças Núcleo de Imagem Instituto de microscopia confocal e Jian Zhang para a sugestão de montar seções usando pérolas de agarose. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder DC010387.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica | ||
| Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Zeiss | ||
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Peel-A-Way embedding mold | Polysciences | 18986 or 18646A | |
| bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| S100 | Dako | Z0311 | |
| Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
| vacuum grease | Fisher | S41718 | |
| Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |
Referenzen
- Lim, D. J. Functional structure of the organ of Corti: a review. Hear Res. 22, 117-146 (1986).
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- Sun, X., Mariani, F. V., Martin, G. R. Functions of FGF signalling from the apical ectodermal ridge in limb development. Nature. 418, 501-508 (2002).
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