Простая процедура vibratome срезов органа Корти, а затем иммуногистохимии и конфокальной микроскопии описана. Эта процедура позволяет для улучшения сохранения тонкой cytoarchitecture млекопитающих орган Корти, и, следовательно, обеспечивает точную количественную оценку типов клеток.
Млекопитающих кортиева органа высокоупорядоченных сотовой мозаику mechanosensory волосы и nonsensory поддерживающие клетки
(Обзор в 1,2). Визуализация этой клеточной мозаики часто требует, чтобы орган Корти является кросс-секционного. В частности, nonsensory столп и клетки Дейтерса, ядра которых расположены при основании в отношении волосковых клеток, не могут быть визуализированы без перекрестного секционирования кортиева органа. Тем не менее, тонкое cytoarchitecture млекопитающих орган Корти, в том числе тонких цитоплазматических процессов столп и клетки Дейтерса, трудно сохранить обычными гистологическими процедуры, такие как парафин и крио-срезов, которые совместимы со стандартными методами иммуногистохимического окрашивания.
Здесь я опишу простой и надежной процедуру, состоящую из vibratome секционирования улитки, иммуногистохимического окрашивания vibratome секций в целом гору, а затем с помощью конфокальной микроскопии. Эта процедура широко используется для immunhistochemical анализ многих органов, включая почки мыши конечностей, данио кишечника, печени, поджелудочной железы и сердца (см. 3-6 для отдельных примерах). Кроме того, эта процедура была успешен как для обработки изображений и quantitificaton столба номер ячейки в мутанта и контроля органов Корти в обоих эмбрионов и взрослых мышей 7. Этот метод, однако, в настоящее время широко не используется, чтобы исследовать млекопитающих орган Корти. Потенциал для этой процедуры как обеспечить повышенную сохранность тонкой cytoarchitecture из взрослых орган Корти и позволяют количественно оценить различные типы клеток описано.
Процедура vibratome секционирования, а затем иммуногистохимии и конфокальной микроскопии позволяет визуализацию органа Корти с минимальным повреждением тканей. Очевидно, конфокальной снимки, сделанные из внутренних районов в vibratome разделе показывают отличные сохранение клеточной морфо…
The authors have nothing to disclose.
Автор хотел бы отметить использование детских исследований Института Основные изображений для конфокальной микроскопии и доктор Чжан Цзянь за предложение монтировать разделы, используя агарозном бисером. Эта работа финансировалась NIH грант DC010387.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Leica VT1000S Vibrating Blade Microtome | Leica | ||
Zeiss LSM510 laser scanning confocal microscope | Zeiss | ||
Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
Peel-A-Way embedding mold | Polysciences | 18986 or 18646A | |
bovine serum albumin | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
Goat Serum | Invitrogen | 16210-064 | |
S100 | Dako | Z0311 | |
Alexa Fluor 568 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-11036 | 1:1000 dilution |
Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
YO-PRO-1 | Invitrogen | Y3603 | |
vacuum grease | Fisher | S41718 | |
Affi-Gel Blue Gel | Bio-Rad | 153-7301 |