Electric Field-gecontroleerde Directed migratie van neurale stamcellen in 2D-en 3D-omgevingen
Summary
Dit protocol laat zien methoden die worden gebruikt om 2D-en 3D-omgevingen tot stand in de speciaal ontworpen electrotactic kabinet, kan volgen cellen<em> In vivo / ex vivo</em> Met behulp van time-lapse opname op de enkele cel niveau, met het oog op galvanotaxis / electrotaxis en andere cellulaire reacties te onderzoeken om de huidige (DC) elektrische velden (EFS) te sturen.
Abstract
Endogene elektrische velden (EFS) komen van nature voor in vivo en spelen een cruciale rol tijdens het weefsel / orgaan ontwikkeling en regeneratie, waaronder die van het centrale zenuwstelsel 1,2. Deze endogene EF worden gegenereerd door cellulaire regulatie van ionentransport combinatie met de electrische weerstand van cellen en weefsel. Er werd gemeld dat de toegepaste EF behandeling kan functioneel herstel van ruggenmergletsels bij dieren en mensen 3,4 bevorderen. In het bijzonder heeft EF gerichte celmigratie aangetoond in een grote verscheidenheid aan celtypen 5,6, zoals neurale progenitorcellen (NPC) 7,8. De toepassing van gelijkstroom (DC) EF is niet een algemeen beschikbare techniek in de meeste laboratoria. We hebben beschreven gedetailleerde protocollen voor de toepassing van DC EF naar cel-en weefselculturen eerder 5,11. Hier presenteren we een video-demonstratie van standaard methoden op basis van een berekende veldsterkte op te zetten 2D eend 3D-omgevingen voor de NPC's, en cellulaire reacties onderzoeken EF stimulatie, zowel in single cell groeiomstandigheden in 2D, en de organotypische ruggenmerg slice in 3D. De spinale cordslice is een ideale ontvanger weefsel voor het bestuderen van NPC ex vivo gedrag, post-transplantatie, omdat de cytoarchitectonic weefsel organisatie is goed bewaard gebleven binnen deze culturen 9,10. Daarnaast biedt deze ex vivo model maakt het ook mogelijk procedures die niet technisch mogelijk is om cellen te volgen in vivo met behulp van time-lapse opname op de enkele cel niveau. Het is kritisch essentieel cel gedrag evalueren niet alleen een 2D milieu, maar ook in 3D organotypische aandoening die nabootst de in vivo omgeving. Dit systeem zal in hoge resolutie imaging met dekking van glas-gerechten op basis van in weefsel of orgaan cultuur met 3D-tracking van de cel migratie in vitro en ex vivo en kan een tussenstap alvorens op in vivo paradigma's.
Protocol
Discussion
De protocollen die we gebruiken zijn gebaseerd op eerdere studies 5,11. Met behulp van deze methoden, stabiele cultuur en elektrische huidige omstandigheden kan worden gehandhaafd, terwijl het aanbrengen van een EF via agar bruggen, Steinberg's oplossing en Ag / AgCl elektroden, om cellen of schijfjes gekweekt in speciaal ontworpen electrotactic kamers van gestandaardiseerde en nauwkeurige afmetingen. De diepte van kamers kan worden aangepast aan geschikt voor verschillende diktes monster 11 en…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Royal Society URF subsidie UF051616, Verenigd Koninkrijk en de European Research Council StG subsidie 243.261 tot BS. Het werk in MZ lab wordt ook ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde subsidie RB1-01417.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | B.D. Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | Gibco | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
Referenzen
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord. PNAS. 77, 1209-1209 (1980).
- Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial. J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, 457-457 (2006).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).
- Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration. Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).
- Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Song, B., Gu, Y., Pu, j. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).
