2D ve 3D Ortamlarda Sinir Progenitör Hücreleri Elektrik Alanı kontrollü Yönetmen Göç
Summary
Bu protokol hücreleri izleyebilirsiniz özel tasarımlı electrotactic odalarında 2D ve 3D ortamlar oluşturmak için kullanılan yöntemler, gösteriyor<em> In vivo / ex vivo</em> Akım (DC) elektrik alanlar (EF'in) yönlendirmek için galvanotaksis / electrotaxis ve diğer hücresel yanıtları incelemek amacıyla, tek hücre seviyesinde time-lapse kayıt kullanarak.
Abstract
Endojen elektrik alanlar (EF'in) in vivo doğal olarak bulunur ve merkezi sinir sistemi 1,2 de dahil olmak üzere doku / organ gelişimi ve yenilenmesi sırasında kritik bir rol oynar. Bu endojen EF'in hücre ve dokuların elektriksel direnci ile birlikte iyonik ulaşım hücresel regülasyon tarafından oluşturulur. Bu uygulamalı EF tedavi hayvanlarda ve insanlarda 3,4 omurilik yaralanmalarında fonksiyonel onarım teşvik ettiği bildirilmiştir. Özellikle, EF-yönlendirmeli hücre göçü sinir progenitör hücreleri (NPCs) 7,8 dahil olmak üzere hücre tipleri 5,6 geniş bir yelpazede, kanıtlanmıştır. Doğru akım (DC) EF'in Uygulama en laboratuarlarında yaygın olarak mevcut bir teknik değildir. Biz hücre ve doku kültürleri, daha önce 5,11 DC EF'in uygulanması için ayrıntılı protokoller tanımlamışlardır. Burada 2D bir kurmak için hesaplanan alan gücüne dayalı standart yöntemlerin bir video gösterisi sunmakNPC d 3D ortamlarda, ve 2D hem de tek hücre büyümesi koşullarında EF stimülasyon ve 3D organotipik omurilik dilim hücresel yanıtları incelemektir. Spinal cordslice cytoarchitectonic doku organizasyon iyi bu kültürlerin 9,10 içinde korunmuş çünkü NPC ex vivo davranışları, transplantasyon sonrasında, eğitim için ideal bir alıcı dokudur. Ayrıca, bu ex vivo model de tek hücre seviyesinde time-lapse kayıt kullanılarak in vivo olarak hücreleri izlemek için teknik olarak mümkün değildir prosedürleri sağlar. Bu eleştirel bir 2D ortamda sadece hücre davranışlarını değerlendirmek için gerekli değil, aynı zamanda in vivo ortamda taklit edebilmektedir 3D organotipik durumdadır. Bu sistem sağlayacak in vitro ve ex vivo olarak tek hücre göç 3D izleme ile doku veya organ kültüründe kapak cam tabanlı yemekleri kullanarak ve vi geçmeden önce bir ara adım olabilir yüksek çözünürlüklü görüntülemevo paradigmalar.
Protocol
Discussion
Kullandığımız protokolleri önceki çalışmalarda 5,11 dayanmaktadır. Standart ve hassas boyutlarda özel tasarlanmış electrotactic odaları kültüre hücreleri veya dilimleri için agar köprüler, Steinberg çözümü ve Ag / AgCl elektrot aracılığı ile bir EF uygularken bu yöntemleri kullanarak, istikrarlı bir kültür ve elektrik mevcut koşullar sağlanabilir. Odacık derinliği farklı örnek 11 kalınlığı için uygun şekilde ayarlanabilir, ve hücrelerin durumda, oda boyut…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Royal Society URF hibe UF051616, Birleşik Krallık ve BS Avrupa Araştırma Konseyi StG hibe 243.261 tarafından desteklenmiştir. MZ laboratuvar çalışmaları da Rejeneratif Tıp hibe RB1-01.417 bir California Institute tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | B.D. Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | Gibco | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
Referenzen
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord. PNAS. 77, 1209-1209 (1980).
- Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial. J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, 457-457 (2006).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).
- Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration. Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).
- Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Song, B., Gu, Y., Pu, j. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).
