Электрическое поле контролируемых Режиссер миграции нервных клеток предшественников в 2D и 3D среде
Summary
Этот протокол свидетельствует о методах, используемых для создания 2D и 3D окружение в специально разработанных камер electrotactic, которые могут отслеживать клетки<em> В естественных условиях / экс естественных условиях</em> С помощью замедленной записи на одном уровне клетки, для того, чтобы исследовать гальванотаксиса / анодной и других клеточных ответов на постоянном токе (DC) электрического поля (EFS).
Abstract
Эндогенные электрического поля (EFS) встречаются в природе в естественных условиях и играют важную роль в ткани / органа развитие и возрождение, в том числе и центральной нервной системы 1,2. Эти эндогенные КВ генерируются клеточной регуляции ионного транспорта в сочетании с электрическим сопротивлением клеток и тканей. Было сообщено, что прикладная EF лечение может способствовать функциональной ремонта повреждений спинного мозга у животных и человека 3,4. В частности, EF-направленной миграции клеток было продемонстрировано в разнообразные типы клеток 5,6, в том числе нервных клеток предшественников (НПС) 7,8. Применение постоянного тока (DC) КВ не является общедоступным техника в большинстве лабораторий. Мы описали подробные протоколы для применения КВ постоянного тока для культур клеток и тканей ранее 5,11. Здесь мы представляем видео демонстрации стандартных методов, основанных на рассчитываются поля создать 2Dг 3D-среды для NPC, и исследовать клеточный ответ на стимуляцию EF как в одной ячейке условий роста в 2D, так и органотипической спинной кусок шнура в 3D. Спинной cordslice является идеальным ткани получателя для изучения NPC бывших естественных поведения, после трансплантации, потому что цитоархитектоники организации ткани хорошо сохранились в этих культурах 9,10. Кроме того, это бывшие модели естественных также позволяет процедуры, которые технически невозможно отследить клеток в живом использование покадровой записи на одном уровне клетки. Крайне важно оценить поведение клетки не только в 2D-среде, но и в 3D органотипической условие, которое mimicks в естественных условиях окружающей среды. Эта система позволит изображений с высоким разрешением использования покровного стекла на основе блюд в ткани или органе культуры с 3D-слежения одного миграции клеток в пробирке и бывших естественных условиях и может быть промежуточный этап перед переходом на в VIВ.О. парадигм.
Protocol
Discussion
Протоколов, которые мы используем, на основе предыдущих исследований 5,11. Используя эти методы, стабильной культуры и электрический ток условиях может быть обеспечена при применении EF через агар мостов, решение Steinberg, и Ag / AgCl электродов, в клетки или кусочки культивировали в специ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа выполнена при финансовой поддержке Королевского общества СПС грант UF051616, Великобритания и Европейский исследовательский совет StG грант на 243 261 BS. Работа в лаборатории МЗ также поддерживается Калифорнийского института регенеративной медицины грант RB1-01417.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| FGF-basic Recombinant Human | Invitrogen | PHG0026 | 20 ng/mL |
| EGF Recombinant Human | Invitrogen | PHG0311 | 20 ng/mL |
| N2-Supplement (100X) liquid | Invitrogen | 02048 | |
| DMEM/F12 medium (high glucose) | Invitrogen | 31330-095 | |
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Natural mouse Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| Growth factor reduced Basement Membrane Matrix (Matrigel) | B.D. Biosciences | 354230 | |
| HEPES buffer | Gibco | 15630 | |
| McIlwain tissue chopper | The Mickle Laboratory Engineering Co Ltd | TC752-PD | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554 |
Referenzen
- Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. Wound healing with electric potential. N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).
- McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. Controlling cell behavior electrically: current views and future potential. Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).
- Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord. PNAS. 77, 1209-1209 (1980).
- Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial. J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).
- Zhao, M., Song, B., Pu, J. Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN. Nature. 442, 457-457 (2006).
- Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons. J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).
- Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration. Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).
- Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors. Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy. Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).
- Song, B., Gu, Y., Pu, j. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).
