哺乳類のリンカーヒストンサブタイプの発現解析
Summary
我々はH1リンカーヒストンの発現レベルを分析するためのアッセイのセットを記述します。 H1ヒストンのタンパク質定量をHPLC分析することによって達成される一方、個々のH1遺伝子のmRNAを定量的、リアルタイムPCRに続いてランダムプライマーに基づいて逆転写反応によって測定される。
Abstract
リンカーヒストンH1は高次構造にクロマチンの折り畳みを促進する、ヌクレオソームコア粒子とリンカーDNAに結合する。 H1は、哺乳動物の開発1に必須であり、 生体内 2-4 に 、特定の遺伝子発現を調節する。高度に保存されたヒストンタンパク質のうち、H1リンカーヒストンの家族は最も異質グループです。差動、開発中に、異なる種類の細胞で規制されている哺乳類の11のH1サブタイプがあります。これらのH1サブタイプは、5体H1S（H1A-E）、交換H1 0、4生殖細胞特異的H1サブタイプ、およびH1x 5があります 。 DNA結合親和性とクロマチンの圧縮能力6-9に異なる複数のH1サブタイプの存在は、クロマチン機能の変調の追加レベルを提供します。したがって、個々のH1サブタイプの定量的な発現解析、mRNAとタンパク質の両方が、それ以上の規制をより良く理解するために必要です注文クロマチンの構造と機能。
ここでは、個々のH1サブタイプ（ 図1）の発現レベルを分析するために設計されたアッセイのセットを記述する。様々なH1バリアント遺伝子のmRNAの発現は、より速くより正確に、ノーザンブロット分析の代替的アプローチと比べてはるかに少ないサンプルを必要とする高感度かつ定量的逆転写-PCR（定量RT-PCR）アッセイのセットにより測定されます。他のほとんどの細胞mRNAのメッセージとは異なり、H1遺伝子の大部分を含むほとんどのヒストン遺伝子、のmRNAは、長いポリAテールを欠いているが、3 '非翻訳領域（UTR）10時ステム-ループ構造が含まれています。したがって、cDNAをランダムプライマーの代わりにオリゴdTプライマーを用いて逆転写によって全RNAから調製されています。各H1サブタイプに特異的なプライマー（ 表1）リアルタイムPCRアッセイは、個々のH1サブタイプのmRNAレベルの高い定量的な測定を得るために実行されます。だ。ハウスキーピング遺伝子の発現が正常化するためのコントロールとして解析されています。
各H1亜型とコアヒストンのタンパク質の相対量は、11月13日 、哺乳動物細胞から抽出した全ヒストンの逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）解析によって得られます。 HPLC法と溶出条件は、マウスのH1サブタイプの最適分離を与えるここで説明する。 HPLCプロファイルを定量化することによって、我々はH1ファミリー内の個々のH1サブタイプの相対的な割合を計算し、同様に細胞内でヌクレオソーム比にH1を決定します。
Protocol
Discussion
アッセイのセットは、哺乳類のリンカーヒストンサブタイプの発現レベルの包括的な分析を可能にするここで提示した。適切に設計された定量RT-PCRアッセイは、任意の哺乳動物ヒストンH1遺伝子からのRNAメッセージの機密性の高い正確な測定を提供しています。リンカーヒストンサブタイプ遺伝子の定量RT-PCRアッセイの重要な部分は、逆転写をベースにランダムプライマーを用いて、cDNAの調?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIHの助成金GM085261とグルジアがん連合著名な学者賞（YFまで）でサポートされています。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | AMP-D1 |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 |
| Microseal ‘B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 |
| Sucrose | Agros Organics | AC40594 |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Applied Science | 11836153001 |
| EDTA | Sigma | E-5134 |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR | VW3648-3 |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Agros Organics | AC42330 |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J.T.Baker | 9470-01 |
Referenzen
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