Анализ экспрессии млекопитающих Linker-гистонов подтипы
Summary
Мы описываем набор тестов для анализа уровня экспрессии гистонов H1 компоновщика. мРНК отдельных генов H1 количественно измеряемых случайных грунтовка на основе обратной транскрипции следует ПЦР в реальном времени, в то время как белок количественно H1 гистонов достигается за счет анализа ВЭЖХ.
Abstract
Компоновщик гистона H1 связывается с нуклеосом частиц ядра и компоновщик ДНК, способствуя складной хроматина высшего порядка в структуре. H1 имеет важное значение для развития млекопитающих 1 и регулирует конкретные экспрессии генов в естественных условиях 2-4. Среди высоко консервативных белков гистонов, семья гистонов H1 компоновщик является наиболее разнородную группу. Есть 11 подтипов H1 у млекопитающих, которые дифференциально регулируется в процессе развития и в разных типах клеток. Эти подтипы H1 включает 5 соматических H1s (H1a-е), замена H1 0, 4 половых клеток конкретного подтипа Н1, и H1x 5. Наличие нескольких подтипов H1, которые отличаются в ДНК сродство хроматина и уплотнение способностью 6-9 обеспечивает дополнительный уровень модуляции функции хроматина. Таким образом, количественный анализ экспрессии отдельных подтипов H1, как мРНК и белков, необходимых для лучшего понимания регулирования высшегопорядок структуры хроматина и функции.
Здесь мы опишем набор тестов предназначен для анализа уровня экспрессии отдельных подтипов H1 (рис. 1). экспрессию мРНК различных генов вариант H1 измеряется набор высокочувствительных и количественные обратной транскрипции-ПЦР (QRT-PCR) анализы, которые быстрее, точнее и требуют гораздо меньше образцов по сравнению с альтернативным подходом Северной блоттинга. В отличие от большинства других клеточных сообщения мРНК, мРНК для большинства генов гистонов, в том числе большинство H1 генов, не имеют длинный хвост полиА, но содержат стволовые структуры петли на 3-нетранслируемой области (УТР) 10. Таким образом, кДНК готовят из общей РНК путем обратной транскрипции с использованием случайных праймеров, а не олиго-дТ праймеров. Realtime анализы ПЦР с праймеров, специфичных для каждого подтипа Н1 (табл. 1) выполняется для получения высокой количественного определения мРНК отдельных подтипом H1с. Экспрессия генов домашнего хозяйства анализируются в качестве контроля для нормализации.
Относительное содержание белков каждого подтипа Н1 и стержневых гистонов получается путем обратной фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) анализ всех гистонов извлечены из клеток млекопитающих, 11-13. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и элюирования условиях, описанных здесь, дают оптимальное разделение подтипов H1 мыши. По количественному профиля ВЭЖХ, вычислить удельный вес отдельных подтипов H1 H1 в семье, а также определить H1 в нуклеосомы отношения в клетках.
Protocol
Discussion
Набор тестов, представленные здесь включить всесторонний анализ уровня экспрессии млекопитающих компоновщик гистонов подтипов. Правильно спроектированные QRT-ПЦР обеспечивают высокую чувствительность и точность измерений сообщений РНК с любого млекопитающего гистонов гены H1. Важно…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке гранта от НИЗ GM085261 и Коалиция Грузии Рак Уважаемые премии ученого (к YF).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| RNase Zap | Applied Biosystems | AM9780 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-018 |
| SuperScriptIII | Invitrogen | 18080-051 |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | BP2818-4 |
| IQ SYBR Green | Bio-Rad | 170-8880 |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | AMP-D1 |
| Microseal 96-well PCR plate | Bio-Rad | MSP-9605 |
| Microseal ‘B’ Adhesive Seals | Bio-Rad | MSB-1001 |
| Sucrose | Agros Organics | AC40594 |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na2HPO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP332 |
| Sodium chloride (NaCl) | American Bioanalytical | AB01915 |
| Sodium dihydrogen phosphate heptahydrate (NaH2PO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP-330 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 |
| Complete Mini proteinase inhibitor cocktail tablet | Roche Applied Science | 11836153001 |
| EDTA | Sigma | E-5134 |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | American Bioanalytical | AB01620 |
| Nonidet-40 (NP-40) | American Bioanalytical | AB01425 |
| Potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366 |
| Tris [hydroxymethyl aminomethane] | American Bioanalytical | AB02000 |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | VWR | VW3648-3 |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Agros Organics | AC42330 |
| Bradford Protein Assay | Bio-Rad | 500-0001 |
| Acetonitrile | EMD | AX0145-1 |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | J.T.Baker | 9470-01 |
Referenzen
- Fan, Y. H1 linker histones are essential for mouse development and affect nucleosome spacing in vivo. Mol. Cell Biol. 23, 4559-4572 (2003).
- Woodcock, C. L., Skoultchi, A. I., Fan, Y. Role of linker histone in chromatin structure and function: H1 stoichiometry and nucleosome repeat length. Chromosome Res. 14, 17-25 (2006).
- Shen, X., Gorovsky, M. A. Linker histone H1 regulates specific gene expression but not global transcription in vivo. Cell. 86, 475-483 (1996).
- Alami, R. Mammalian linker-histone subtypes differentially affect gene expression in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 5920-5925 (2003).
- Happel, N., Doenecke, D. Histone H1 and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. Gene. 431, 1-12 (2009).
- Clausell, J., Happel, N., Hale, T. K., Doenecke, D., Beato, M. Histone H1 subtypes differentially modulate chromatin condensation without preventing ATP-dependent remodeling by SWI/SNF or NURF. PLoS One. 4, 0007243-0007243 (2009).
- Khadake, J. R., Rao, M. R. DNA- chromatin-condensing properties of rat testes H1a and H1t compared to those of rat liver H1bdec; H1t is a poor condenser of chromatin. Biochemie. 34, 15792-15801 (1995).
- Orrego, M. Differential affinity of mammalian histone H1 somatic subtypes for DNA and chromatin. BMC Biol. 5, 22-22 (2007).
- Th’ng, J. P., Sung, R., Ye, M., Hendzel, M. J. H1 family histones in the nucleus. Control of binding and localization by the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 280, 27809-27814 (2005).
- Wang, Z. F., Sirotkin, A. M., Buchold, G. M., Skoultchi, A. I., Marzluff, W. F. The mouse histone H1 genes: gene organization and differential regulation. J. Mol. Biol. 271, 124-138 (1997).
- Brown, D. T., Sittman, D. B. Identification through overexpression and tagging of the variant type of the mouse H1e and H1c genes. J. Biol. Chem. 268, 713-718 (1993).
- Fan, Y., Sirotkin, A., Russell, R. G., Ayala, J., Skoultchi, A. I. Individual somatic H1 subtypes are dispensable for mouse development even in mice lacking the H1(0) replacement subtype. Mol. Cell. Biol. 21, 7933-7943 (2001).
- Fan, Y., Skoultchi, A. I. Genetic analysis of H1 linker histone subtypes and their functions in mice. Methods Enzymol. 377, 85-107 (2004).
- Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6, 986-994 (1996).
