Een Cre-Lox P Recombinatie Aanpak voor de detectie van celfusie In Vivo</em
Summary
Een methode om celfusie track in levende organismen na verloop van tijd wordt beschreven. De aanpak maakt gebruik van Cre-<em> LoxP</em> Recombinatie om luciferase expressie te induceren bij celfusie. De gegenereerde chemiluminescentie-signaal kan worden gedetecteerd in levende organismen, waarbij biofotonische beeldvormende systemen met een gevoeligheid van detectie van ~ 1.000 cellen in perifere weefsels.
Abstract
Het vermogen van twee of meer cellen van hetzelfde type te fuseren is gebruikt in meercelligen doorheen de evolutie van vele complexe organen, waaronder het skelet spieren, botten en placenta vormen. Hedendaagse studies tonen fusie van cellen van hetzelfde type verleent verbeterde functie. Bijvoorbeeld, wanneer de trofoblast cellen van de placenta zekering te vormen van de syncytiotrophoblast, de syncytiotrophoblast is beter in staat om voedingsstoffen en hormonen in de moeder en foetus barrière dan niet-gefuseerde trophoblasts 1-4 vervoer. Meer recente studies laten zien fusie van cellen van verschillende types kunnen lot van de cel direct. De 'terugkeer' of wijziging van lot van de cel door een fusie werd ooit gedacht worden beperkt tot celkweek systemen. Maar de komst van de stamceltransplantatie geleid tot de ontdekking door ons en anderen die stamcellen kunnen met somatische cellen zekering in vivo en dat fusie vergemakkelijkt stamcellen differentiatie 5-7. Zo, celfusie is een gereguleerd proces capable van de bevordering van cel overleving en differentiatie en dus kan worden van essentieel belang voor de ontwikkeling, het herstel van weefsels en zelfs de pathogenese van de ziekte.
Het beperken van de studie van de cel fusie, is het gebrek aan geschikte technologie 1) nauwkeurig te identificeren fusie producten en 2) volgen fusie-producten in de tijd. Hier presenteren we een nieuwe benadering voor zowel de beperkingen aan te pakken via inductie van bioluminescentie bij fusie (figuur 1);. Bioluminescentie kan worden gedetecteerd met een hoge gevoeligheid in vivo 8-15 We maken gebruik van een construct dat codeert voor de vuurvlieg luciferase (Photinus pyralis) gen geplaatst grenzend aan een stopcodon geflankeerd door loxP sequenties. Bij de cellen die dit gen fuseren met cellen die het Cre recombinase eiwit, de loxP sites zijn gesplitst en het stopsignaal wordt weggesneden waardoor de transcriptie van luciferase. Omdat het signaal is induciBLE, de incidentie van vals-positieve signalen is zeer laag. In tegenstelling tot bestaande methoden die het Cre / loxP systeem 16, 17 gebruiken, hebben wij opgenomen een "levend" detectiesignaal en daarmee betalen voor de eerste keer de kans om de kinetiek van celfusie track in vivo.
Om aan te tonen van de aanpak, muizen alom uiten van Cre-recombinase diende als ontvangers van stamcellen getransfecteerd met een luciferase te bouwen om stroomafwaarts van een floxed stopcodon uit te drukken. Stamcellen werden getransplanteerd via intramyocardial injectie en na transplantatie intravitale beeldanalyse werd uitgevoerd om de aanwezigheid van spoor fusie producten in het hart en de omliggende weefsels in de tijd. Deze aanpak kan worden aangepast aan de celfusie te analyseren in elk weefseltype in elk stadium van ontwikkeling, ziekte of volwassen weefsel te herstellen.
Protocol
Discussion
De methode die hier beschreven staat, voor de eerste keer, discrete identificatie en temporele analyse van de celfusie in organismen, met inbegrip van kleine dieren. De aanpak combineert Cre-loxP recombinatie met daaropvolgend biofotonische beeldanalyse. De aanpak is vatbaar voor het bijhouden van niet alleen de cel-cel fusie, maar ook virus-cel fusie en zo kan nuttig zijn voor het bijhouden van virale infecties. Beeldanalyse is snel en het is mogelijk om de afbeelding meerdere kleine dieren tegelijk. Detectie v…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dr Peiman Hemmati (Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison) bedanken voor ruim het verstrekken van de H1 MSC's, en Dr Tim Hacker, Dr Gouqing Song en mevrouw Jill Koch van de Universiteit van Wisconsin Cardiovasculaire Fysiologie Core Faciliteit voor het uitvoeren van de muis operaties. Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation door middel van een Graduate Research Fellowship aan Brian Freeman en NIH R21 HL089679.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone, Logan UT | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11140-050 |
Referenzen
- Bernirschke, K. K. P. . Pathology of the Human Placenta. , (2000).
- Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).
- Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. Trophoblast deportation in human pregnancy–its relevance for pre-eclampsia. Placenta. 20, 531-539 (1999).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia. Placenta. 21, 597-602 (2000).
- Ogle, B. M. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo. FASEB. J. 18, 548-550 (2004).
- Nygren, J. M. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 10, 494-501 (2004).
- Nygren, J. M. Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion. Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).
- Kutschka, I. Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts. Circulation. 114, I174-I180 (2006).
- Min, J. J. In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium. Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).
- Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice. Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).
- Weir, L. R. Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity. Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).
- Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O’Callaghan, D., Splitter, G. A. Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice. Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).
- Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice. Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).
- Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).
- Zhu, L. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).
- Noiseux, N. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).
- Ajiki, T. Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site. Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).
- Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
