Cre-P לקס גישה רקומבינציה לצורך זיהוי של Fusion Cell In vivo</em
Summary
שיטה כדי לעקוב אחר איחוי תא אורגניזמים חיים על פני זמן מתואר. הגישה מנצל Cre-<em> LoxP</emרקומבינציה> לגרום הביטוי בלוציפראז על איחוי תאים. האות זורח שנוצר ניתן להבחין יצורים חיים באמצעות מערכות הדמיה biophotonic עם רגישות של גילוי של ~ 1,000 תאים ברקמות היקפי.
Abstract
היכולת של שני תאים או יותר מאותו סוג הפתיל נוצל metazoans במהלך האבולוציה כדי ליצור איברים מורכבים רבים, כולל שרירים ועצמות השלד, ואת השליה. מחקרים עכשוויים מראים היתוך של תאים מאותו סוג מעניקה פונקציה משופרת. למשל, כאשר תאים trophoblast של הפתיל את השליה לטופס syncytiotrophoblast, syncytiotrophoblast הוא טוב מסוגל להעביר חומרים מזינים והורמונים דרך מחסום אימהית, העובר מאשר trophoblasts unfused 1-4. מחקרים מאוחרים יותר מראים היתוך של תאים מסוגים שונים יכול לכוון גורל התא. "חזרה" או שינוי גורל התא על ידי היתוך חשבו פעם להיות מוגבל במערכות תרבית תאים. אבל הופעתו של השתלת תא גזע הובילו לגילוי על ידינו ואחרים בתאי גזע יכול להתמזג עם תאים סומטיים in vivo ו היתוך המאפשר בידול תא גזע 5-7. לפיכך, המיזוג התא תהליך מוסדר גapable לקידום הישרדות התא בידול ולכן יכול להיות בעל חשיבות מרכזית לתיקון הפיתוח של רקמות ואפילו בפתוגנזה של המחלה.
הגבלת המחקר של היתוך התא, הוא היעדר טכנולוגיה מתאימה 1) לזהות במדויק מוצרים היתוך ו 2) היתוך מוצרים לעקוב לאורך זמן. כאן אנו מציגים גישה חדשנית לטיפול הן המגבלות באמצעות אינדוקציה של פליטת אור על היתוך (איור 1):. פליטת אור ניתן לאתר עם רגישות גבוהה in vivo 8-15 אנו מנצלים לבנות קידוד בלוציפראז גחלילית (Photinus pyralis) הגן ממוקם בסמוך קודון להפסיק מוקף רצפים LoxP. כאשר תאים להביע את הפתיל גן עם תאים המבטאים את חלבון recombinase Cre, אתרי LoxP הם ביקע את האות לעצור הוא נכרת ומאפשר שעתוק של בלוציפראז. בגלל האות inducible, שכיחות חיוביות שגויות אותות נמוך מאוד. בניגוד לשיטות הקיימות אשר מנצלים את Cre / מערכת LoxP 16, 17, יש לנו שולבו "חי" אות זיהוי ובכך להרשות בפעם הראשונה את ההזדמנות כדי לעקוב אחר קינטיקה של איחוי תאים in vivo.
כדי להדגים את הגישה, עכברים בכל מקום בגוף להביע Cre recombinase שימש מקבלי בתאי גזע transfected עם לבנות להביע את הזרם בלוציפראז של קודון עצירה floxed. בתאי גזע הושתלו באמצעות הזרקה intramyocardial ואחרי ניתוח השתלת intravital תמונה נערך כדי לעקוב אחר נוכחות היתוך מוצרים הלב הרקמות הסובבות לאורך זמן. גישה זו יכולה להיות מותאם לנתח איחוי תאים בכל סוג רקמה בכל שלב של המחלה ופיתוח, או לתקן רקמות מבוגר.
Protocol
Discussion
השיטה המתוארת כאן מאפשר, לראשונה, זיהוי וניתוח בדידה הזמני של איחוי תאים באורגניזמים, כולל חיות קטנות. הגישה משלבת Cre-LoxP רקומבינציה עם ניתוח שלאחר מכן תמונה biophotonic. הגישה ניתנת למעקב לא רק תאים תאים היתוך, אלא גם וירוס תאים היתוך ולכן יכול להיות שימושי עבור מעקב אחר זיה…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר Peiman Hemmati (המחלקה לרפואה, אוניברסיטת וויסקונסין) עבור בנדיבות מתן MSCs H1, ואת ד"ר טים האקר, ד"ר Gouqing שיר גב 'ג'יל קוך של אוניברסיטת ויסקונסין לב וכלי דם פיזיולוגיה Core Facility לביצוע ניתוחים העכבר. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדע באמצעות מלגת מחקר לתארים מתקדמים על בריאן פרימן NIH R21 HL089679.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone, Logan UT | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11140-050 |
Referenzen
- Bernirschke, K. K. P. . Pathology of the Human Placenta. , (2000).
- Hoshina, M., Boothby, M., Boime, I. Cytological localization of chorionic gonadotropin alpha and placental lactogen mRNAs during development of the human placenta. J. Cell. Biol. 93, 190-198 (1982).
- Johansen, M., Redman, C. W., Wilkins, T., Sargent, I. L. Trophoblast deportation in human pregnancy–its relevance for pre-eclampsia. Placenta. 20, 531-539 (1999).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Placental debris, oxidative stress and pre-eclampsia. Placenta. 21, 597-602 (2000).
- Ogle, B. M. Spontaneous fusion of cells between species yields transdifferentiation and retroviral transfer in vivo. FASEB. J. 18, 548-550 (2004).
- Nygren, J. M. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat. Med. 10, 494-501 (2004).
- Nygren, J. M. Myeloid and lymphoid contribution to non-haematopoietic lineages through irradiation-induced heterotypic cell fusion. Nat. Cell. Biol. 10, 584-592 (2008).
- Kutschka, I. Adenoviral human BCL-2 transgene expression attenuates early donor cell death after cardiomyoblast transplantation into ischemic rat hearts. Circulation. 114, I174-I180 (2006).
- Min, J. J. In vivo bioluminescence imaging of cord blood derived mesenchymal stem cell transplantation into rat myocardium. Ann. Nucl. Med. 20, 165-170 (2006).
- Malstrom, S. E., Tornavaca, O., Meseguer, A., Purchio, A. F., West, D. B. The characterization and hormonal regulation of kidney androgen-regulated protein (Kap)-luciferase transgenic mice. Toxicol. Sci. 79, 266-277 (2004).
- Weir, L. R. Biophotonic imaging in HO-1.luc transgenic mice: real-time demonstration of gender-specific chloroform induced renal toxicity. Mutat. Res. 574, 67-75 (2005).
- Rajashekara, G., Glover, D. A., Banai, M., O’Callaghan, D., Splitter, G. A. Attenuated bioluminescent Brucella melitensis mutants GR019 (virB4), GR024 (galE), and GR026 (BMEI1090-BMEI1091) confer protection in mice. Infect. Immun. 74, 2925-2936 (1090).
- Kadurugamuwa, J. L. Noninvasive biophotonic imaging for monitoring of catheter-associated urinary tract infections and therapy in mice. Infect. Immun. 73, 3878-3887 (2005).
- Ryan, P. L., Youngblood, R. C., Harvill, J., Willard, S. T. Photonic monitoring in real time of vascular endothelial growth factor receptor 2 gene expression under relaxin-induced conditions in a novel murine wound model. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1041, 398-414 (2005).
- Zhu, L. Non-invasive imaging of GFAP expression after neuronal damage in mice. Neurosci. Lett. 367, 210-212 (2004).
- Noiseux, N. Mesenchymal stem cells overexpressing Akt dramatically repair infarcted myocardium and improve cardiac function despite infrequent cellular fusion or differentiation. Mol. Ther. 14, 840-850 (2006).
- Ajiki, T. Composite tissue transplantation in rats: fusion of donor muscle to the recipient site. Transplant Proc. 37, 208-209 (2005).
- Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Exp. Hematol. 36, 350-359 (2008).
- Ogle, B. M., Cascalho, M., Platt, J. L. Biological implications of cell fusion. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 6, 567-575 (2005).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
