Un Cre-Lox P approccio ricombinazione per la rilevazione di fusione cellulare In Vivo</em
Summary
Un metodo per tenere traccia fusione cellulare in organismi viventi nel corso del tempo è descritto. L'approccio utilizza Cre-<em> LoxP</emRicombinazione> per indurre l'espressione luciferasi sulla fusione cellulare. Il segnale luminescente generato può essere rilevato negli organismi viventi con sistemi di imaging Biophotonic con una sensibilità di rilevazione di circa 1.000 cellule nei tessuti periferici.
Abstract
La capacità di due o più cellule dello stesso tipo di fusibile è stato utilizzato nei metazoi nel corso dell'evoluzione per formare molti organi complessi, inclusi i muscoli scheletrici, ossa e placenta. Studi contemporanei dimostrano la fusione di cellule dello stesso tipo conferisce funzioni avanzate. Per esempio, quando le cellule del trofoblasto della placenta fondono per formare il sinciziotrofoblasto, il sinciziotrofoblasto è più in grado di trasportare le sostanze nutritive e gli ormoni attraverso la barriera materno-fetale di trophoblasts non condensato 1-4. Studi più recenti dimostrano la fusione di cellule di tipo diverso possono indirizzare il destino della cellula. Il "ritorno" o la modifica del destino delle cellule di fusione era una volta pensato per essere limitata a sistemi di colture cellulari. Ma l'avvento del trapianto di cellule staminali hanno portato alla scoperta da noi e altri che le cellule staminali possono fondersi con le cellule somatiche in vivo e che la fusione facilita la differenziazione delle cellule staminali 5-7. Così, la fusione cellulare è un processo regolato capable di promuovere la sopravvivenza cellulare e della differenziazione, e quindi potrebbe essere di fondamentale importanza per lo sviluppo, la riparazione dei tessuti e anche la patogenesi della malattia.
Limitare lo studio della fusione cellulare, è la mancanza di tecnologie adeguate a 1) identificare accuratamente prodotti di fusione e di 2) prodotti di fusione traccia nel tempo. Qui vi presentiamo un nuovo approccio per affrontare sia le limitazioni attraverso l'induzione di bioluminescenza su fusione (Figura 1). Bioluminescenza è possibile rilevare con alta sensibilità in vivo 8-15 Utilizziamo un costrutto che codifica per la luciferasi lucciola (Fotino pyralis) gene collocato adiacente al un codone di stop affiancato da sequenze loxP. Quando le cellule che esprimono questo gene fondono con cellule che esprimono la proteina Cre ricombinasi, i siti loxP sono spaccati e il segnale di stop è escisse che permette la trascrizione della luciferasi. Poiché il segnale è induciBLE, l'incidenza di falsi positivi segnali è molto bassa. A differenza dei metodi esistenti che utilizzano il Cre / loxP sistema 16, 17, abbiamo incorporato un segnale "vivente" di rilevazione e quindi permettere per la prima volta l'opportunità di monitorare la cinetica di fusione cellulare in vivo.
Per dimostrare l'approccio, i topi che esprimono ubiquitariamente Cre ricombinasi servito come destinatari di cellule staminali transfettate con un costrutto per esprimere a valle luciferasi di un codone di stop floxed. Cellule staminali sono state trapiantate tramite iniezione intramiocardico e dopo il trapianto di analisi d'immagine intravitale è stata condotta per monitorare la presenza di prodotti di fusione nel cuore e tessuti circostanti nel corso del tempo. Questo approccio potrebbe essere adattato per analizzare la fusione cellulare in qualsiasi tipo di tessuto in qualsiasi stadio di sviluppo, la malattia o la riparazione dei tessuti adulti.
Protocol
Discussion
Il metodo qui descritto consente, per la prima volta, l'identificazione e l'analisi temporale discreto di fusione cellulare negli organismi, compresi gli animali di piccole dimensioni. L'approccio combina Cre-loxP ricombinazione con conseguente analisi delle immagini Biophotonic. L'approccio è suscettibile di monitoraggio non solo cellula-cellula fusion, ma anche la fusione virus-cellula e quindi potrebbe rivelarsi utile per il monitoraggio delle infezioni virali. Analisi delle immagini è rapida ed è …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Peiman Hemmati (Dipartimento di Medicina dell'Università del Wisconsin-Madison) per offrire generosamente la MSC H1, e il dottor Tim Hacker, il Dr. Gouqing Song e la signora Jill Koch della University of Wisconsin Cardiovascolare Fisiologia Fondo centrale per l'esecuzione di interventi chirurgici del mouse. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation attraverso una borsa di studio Graduate Research a Brian Freeman e NIH R21 HL089679.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Neon Transfection System | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK5000 | |
| Neon 100 μL Kit | Invitrogen, Carlsbad, CA | MPK10025 | Contains R and E Buffer |
| a-MEM powder | Invitrogen, Carlsbad, CA | 12000-022 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone, Logan UT | SH30070.03 | |
| B6.C-Tg(CMV-cre)1Cgn/J | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 006054 | |
| Trypsin 10X | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | MT-25-054-Cl | |
| L-Glutamine | Fisher Scientific, Forest Lawn, NJ | 25030-081 | |
| D-Luciferin | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | 122796 | |
| Xenogen Biophotonic Imaging System | Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA | IVIS Spectrum | |
| Sodium Biocarbonate | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | S6014-500G | |
| Non-essential Amino Acids | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11140-050 |
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