Imagerie quantitative de Lineage spécifiques Toll-like Receptor la signalisation médiée par les monocytes et les cellules dendritiques à partir de petits échantillons de sang humain
Summary
Nous décrivons l'utilisation de la technologie ImageStream (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> Www.amnis.com</a>), Qui combine la cytométrie en flux quantitative simultanée à haute résolution d'imagerie numérique, de quantifier les mécanismes cellulaires de cellules immunitaires primaires de cohortes de patients bien définis. Nos études fournissent un modèle pour les recherches translationnelles de quantifier la lignée spécifiques des réponses cellulaires dans de petits échantillons à partir de cohortes soumises.
Abstract
Les variations individuelles dans l'état immunitaire de déterminer les réponses à l'infection et de contribuer à la gravité des maladies et des résultats. Le vieillissement est associé à une susceptibilité accrue aux infections virales et bactériennes et une diminution de la réactivité aux vaccins avec un déclin bien documenté dans humorale ainsi que 1,2 à médiation cellulaire réponses immunitaires. Nous avons récemment évalué les effets du vieillissement sur récepteurs Toll-like (TLR), les composants clés du système immunitaire inné qui permettent de détecter l'infection microbienne et de déclenchement des réponses antimicrobiens défense de l'hôte 3. Dans une large cohorte de donneurs humains sains, nous avons montré que les monocytes du sang périphérique de personnes âgées ont diminué expression et la fonction des TLR 4 et certains niveaux similaires TLR réduits et les réponses de signalisation dans les cellules dendritiques (CD), cellules présentatrices d'antigène qui sont déterminant dans le lien entre l'immunité innée et adaptative 5. Nous avons montré une dérégulation du TLR3 dans les macrophages uned baisse de la production d'IFN par les DC provenant de donneurs âgés en réponse à l'infection par le virus West Nile 6,7.
Paramount à notre compréhension de immunosénescence et à l'intervention thérapeutique est une compréhension détaillée des types de cellules spécifiques répondant et le mécanisme (s) de la transduction du signal. Les études traditionnelles de réponses immunitaires à travers l'imagerie de cellules primaires et des marqueurs de cellules d'arpentage par FACS ou immunoblot ont fait avancer notre compréhension de manière significative, cependant, ces études sont généralement limitées techniquement par le faible volume d'échantillon disponible pour les patients et l'incapacité de procéder à des techniques de laboratoire complexes sur de multiples échantillons humains. ImageStream combine la cytométrie en flux quantitative simultanée imagerie à haute résolution numérique et facilite ainsi l'enquête dans des populations cellulaires multiples simultanément pour une capture efficace de la susceptibilité du patient. Ici, nous montrent l'utilisation de ImageStream dans les PED afin d'évaluer TLR7 / 8activation à médiation augmentation de la phosphorylation et la translocation nucléaire d'un facteur de transcription clé, NF-kB, qui déclenche la transcription de nombreux gènes qui sont essentiels pour les réponses immunitaires 8. Grâce à cette technologie, nous avons aussi récemment démontré une altération précédemment non reconnu de TLR5 signalisation et de la voie NF-kB dans les monocytes de donneurs âgés qui peuvent contribuer à la réponse immunitaire altérée au cours du vieillissement 9.
Protocol
Discussion
Les étapes essentielles de l'utilisation de ImageStream pour les études translationnelles sont la sélection des groupes de comparaison appropriés et l'optimisation et la validation de la spécificité des anticorps. Les différences entre les groupes de sujets dans la cible marqué sera évidente par le biais des histogrammes et des images de cellules. En combinaison avec une analyse approfondie de l'évolution des récepteurs concernés et les voies de signalisation, ces données fourniront des renseign…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu en partie par le NIH (N01 HHSN272201100019C, U19 AI 089992, et le Programme NCRR / GCRC M01-RR00125). Les auteurs déclarent pas d'intérêts financiers concurrents et à remercier le Dr Mark Shlomchik, directeur de l'établissement de cellules de base de Yale trieuse.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848 |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
| BD Perm/Wash | BD Biosciences | 554723 |
| CD14-PE | eBioscience | 12-0149-41 |
| CD4-PacBlue | BD Pharmingen | 68436 |
| Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC | BD Biosciences | 340546 |
| CD11c-PE | BD Biosciences | 347637 |
| CD123-PE | BD Biosciences | 340545 |
| rabbit anti-NF-κB (p65) | SantaCruz | SC-372 |
| Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21246 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| ImageStream X | Amnis |
Table 1. Specific reagents and equipment.
| Cell type | FITC | PE | Alexa 647 | PacBlue |
| Monocyte | CD14 | NF-κB (p65) | ||
| mDC | Lin1 | CD11c | NF-κB (p65) | CD4 |
| pDC | Lin1 | CD123 | NF-κB (p65) | CD4 |
Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways
Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.
Referenzen
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