Quantitative Bildgebung von Lineage-spezifischen Toll-like Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion in Monozyten und dendritischen Zellen aus kleinen Proben des menschlichen Blutes

Summary

Wir beschreiben den Einsatz von ImageStream Technologie (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> Www.amnis.com</a>), Verbindet die quantitative Durchflusszytometrie bei gleichzeitiger hoher Auflösung digital imaging, um zelluläre Mechanismen der primären Immunzellen aus gut definierten Patientengruppen zu quantifizieren. Unsere Studien liefern eine Blaupause für translationale Untersuchungen zur Abstammung spezifische zelluläre Reaktionen in kleinen Proben von Kohorten Thema zu quantifizieren.

Abstract

Individuelle Abweichungen in Immunstatus bestimmen Reaktionen auf Infektionen und zur Schwere der Erkrankung und das Ergebnis. Das Altern ist mit einer erhöhten Anfälligkeit für virale und bakterielle Infektionen assoziiert und verringerte Ansprechbarkeit auf Impfstoffe mit einer gut dokumentierten Rückgang in humorale als auch zellvermittelte Immunreaktionen ^1,2. Wir haben vor kurzem die Auswirkungen der Alterung auf die Toll-like Rezeptoren (TLR), wichtige Bestandteile des angeborenen Immunsystems, die mikrobielle Infektion und Trigger mikrobiellen Abwehr Antworten ³ erkennen beurteilt. In einer großen Kohorte von gesunden menschlichen Spendern, haben wir gezeigt, dass die Monozyten im peripheren Blut von älteren Menschen haben die Expression und Funktion bestimmter TLR ⁴ und ähnlich reduzierte TLR Ebenen und Signalantwort in dendritische Zellen (DCs) verringerte, Antigen-präsentierende Zellen, die entscheidend sind in die Verknüpfung zwischen angeborenen und erworbenen Immunität ^5. Wir haben eine Fehlregulation von TLR3 in Makrophagen gezeigt, eind niedrigere Produktion von IFN durch DCs von älteren Spendern in Reaktion auf eine Infektion mit West-Nil-Virus ^6,7.

Paramount zu unserem Verständnis der Immunoseneszenz und therapeutische Intervention ist ein detailliertes Verständnis der spezifischen Zelltypen reagieren und der Mechanismus (s) der Signaltransduktion. Traditionelle Studien von Immunantworten durch bildgebende von primären Zellen und Vermessung Zellmarker durch FACS oder Immunoblot haben unser Verständnis deutlich, rückte aber diese Studien in der Regel mit technischen Mitteln durch die kleine Stichprobe zur Verfügung stehende Volumen von Patienten und die Unfähigkeit, komplexe Laborverfahren auf mehreren befragen begrenzt humanen Proben. ImageStream kombiniert quantitative Durchflusszytometrie bei gleichzeitiger hoher Auflösung digital imaging und erleichtert somit die Untersuchung in mehreren Zellpopulationen gleichzeitig für eine effiziente Erfassung von Patienten-Anfälligkeit. Hier zeigen wir die Verwendung von ImageStream in DCs zu beurteilen, TLR7 / 8Aktivierung-vermittelten Anstieg der Phosphorylierung und die nukleäre Translokation von einem Schlüssel Transkriptionsfaktors NF-kB, die die Transkription zahlreicher Gene, die für Immunantworten ⁸ initiiert. Mit dieser Technologie haben wir vor kurzem auch eine bisher unbekannte Veränderung TLR5 Signalisierung und der NF-kappaB Signalweg in Monozyten von älteren Spendern, die zu einer veränderten Immunantwort in alternden ⁹ beitragen können, unter Beweis gestellt.

Protocol

1. Isolierung und Stimulation von Immunzellen Erhalten 10-50 ml heparinisierten Blut von gesunden Freiwilligen nach schriftlicher Einwilligung unter den Richtlinien der lokalen Institutional Review Board. Bei Studien von Alterung oder Pathogenese der Erkrankung, Exklusion und Inklusion Kriterien für jeden Freiwilligen oder Patienten müssen explizit bestimmt werden. Isolieren menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) mit CPT-Röhrchen oder Ficoll-Paque Plus nach den Anweisungen des …

Discussion

Die entscheidenden Schritte bei der Verwendung von ImageStream für translationale Studien sind die Auswahl der relevanten Vergleichsgruppen und Optimierung und Validierung von Antikörper-Spezifität. Unterschiede zwischen Fächergruppen in dem markierten Ziel wird leicht ersichtlich sein durch Histogramme und Zellen geben. In Kombination mit einer gründlichen Analyse der Veränderungen in relevanten Rezeptoren und Signalwege, werden diese Daten wertvolle Einblicke in die Mechanismen, die in spezialisierten Immundysre…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
Paraformaldehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15710
BD Perm/Wash	BD Biosciences	554723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen	68436
Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC	BD Biosciences	340546
CD11c-PE	BD Biosciences	347637
CD123-PE	BD Biosciences	340545
rabbit anti-NF-κB (p65)	SantaCruz	SC-372
Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21246
DAPI	Invitrogen	D21490
ImageStream X	Amnis

Table 1. Specific reagents and equipment.

Cell type	FITC	PE	Alexa 647	PacBlue
Monocyte		CD14	NF-κB (p65)
mDC	Lin1	CD11c	NF-κB (p65)	CD4
pDC	Lin1	CD123	NF-κB (p65)	CD4

Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways

Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.