ヒト血液の小さなサンプルから単球および樹状細胞のlineage特異的Toll様受容体を介するシグナル伝達の定量的イメージング
Summary
我々は（のImageStream技術の使用を記述する<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> www.amnis.com</a>）、これは明確に定義された患者のコホートからの主な免疫細胞の細胞メカニズムを定量化するために、同時高解像度のデジタル画像で定量的なフローサイトメトリーを組み合わせたものです。我々の研究は、対象のコホートから少量のサンプルで系統特異的な細胞応答を定量化するためのトランスレーショナル研究のための青写真を提供しています。
Abstract
免疫状態の個々の変動が感染症への対応を決定し、疾患の重症度および予後に貢献しています。エージングは、ウイルスおよび細菌感染症に対する感受性の上昇と関連付けられ、体液によく文書化減少と同様に細胞性免疫応答の1,2のワクチンに反応性を減少させる。我々は最近、Toll様受容体（TLR）は、微生物感染およびトリガ抗菌宿主の防御応答3を検出する自然免疫系の主要なコンポーネントでエージングの効果を評価しています。健康な人間のドナーの大規模コホートでは、我々は、高齢者の末梢血単球は、抗原提示において重要であるセルを特定のTLRは4と同様の削減TLRレベルと樹状細胞のシグナル伝達応答（DCS）の発現と機能が低下している示した自然免疫と獲得免疫の5との間のリンケージ。我々は、マクロファージではTLR3の調節不全を示しているウエストナイルウイルス6,7の感染に応答して、高齢者ドナーからの樹状細胞によるIFNのd低い生産。
免疫老化の我々の理解および治療的介入へのパラマウントは、特定の細胞応答の種類とシグナル伝達の機構（s）の詳細な理解です。 FACSまたはイムノブロットによって初代培養細胞や測量細胞マーカーのイメージングを介して免疫応答の従来の研究では、しかしながら、これらの研究は一般の患者から入手可能な少量のサンプル量と複数の複雑な実験技術を実施することができないことに技術的に制限され、大幅に我々の理解を進めてきたヒトサンプル。のImageStreamは、同時高解像度のデジタル画像の定量的なフローサイトメトリーを組み合わせたため、患者の感受性の効率的な捕獲のための同時期に複数の細胞集団の調査を容易にします。ここでは、TLR7 / 8を評価するために、樹状細胞でのImageStreamの使用方法を示していますリン酸化と免疫応答8の重要な多数の遺伝子の転写を開始する重要な転写因子、NF-κBの核移行の活性化を介する増加します。この技術を用いて、我々はまた、最近では9高齢化で変更された免疫応答性に貢献するかもしれない古いドナーから単球におけるTLR5シグナリングとNF-κB経路の以前に認識されていない変化を示している。
Protocol
Discussion
トランスレーショナル研究のためのImageStreamの使用における重要なステップは、関連する比較グループと抗体特異性の最適化と検証の選択です。標識した標的の対象群間の差は、ヒストグラムとセル画像を介して容易に明らかになるであろう。関連する受容体とシグナル伝達経路の変化の徹底的な分析と組み合わせることで、これらのデータは、専門的なコホートで免疫不全の根底にあるメ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、NIH（N01 HHSN272201100019C、U19 AI 089992、およびNCRR / GCRCプログラムM01-RR00125）によって部分的にサポートされていました。著者らは競合する経済的利益を宣言しないと博士マークShlomchik、エールセルソーターの中核施設のディレクターに感謝します。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 |
| R848 | Invivogen | tlrl-r848 |
| Paraformaldehyde (16%) | Electron Microscopy Sciences | 15710 |
| BD Perm/Wash | BD Biosciences | 554723 |
| CD14-PE | eBioscience | 12-0149-41 |
| CD4-PacBlue | BD Pharmingen | 68436 |
| Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC | BD Biosciences | 340546 |
| CD11c-PE | BD Biosciences | 347637 |
| CD123-PE | BD Biosciences | 340545 |
| rabbit anti-NF-κB (p65) | SantaCruz | SC-372 |
| Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A21246 |
| DAPI | Invitrogen | D21490 |
| ImageStream X | Amnis |
Table 1. Specific reagents and equipment.
| Cell type | FITC | PE | Alexa 647 | PacBlue |
| Monocyte | CD14 | NF-κB (p65) | ||
| mDC | Lin1 | CD11c | NF-κB (p65) | CD4 |
| pDC | Lin1 | CD123 | NF-κB (p65) | CD4 |
Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways
Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.
Referenzen
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