Summary

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

Published: March 07, 2012
doi:

Summary

Wir stellen eine Methode, um ein bildgebendes Fenster in der Maus, die Schädel Millimeter überspannt und ist seit Monaten ohne Entzündung des Gehirns stabil zu bilden. Diese Methode wird auch für longitudinale Studien des Blutflusses, Zelluläre Dynamik und Zell / vaskuläre Struktur mit zwei-Photonen-Mikroskopie geeignet.

Abstract

In-vivo-Bildgebung der kortikalen Funktion erfordert optische Zugang zum Gehirn ohne Störung des intrakraniellen Umwelt. Wir stellen eine Methode, um eine polierte und verstärkte ausgedünnt Schädel (Ports) Fenster in der Maus Schädel, die mehrere Millimeter im Durchmesser überspannt und ist über Monate stabil zu bilden. Der Schädel auf 10 bis 15 um in der Dicke mit einer Hand gehalten Bohrer optische Klarheit zu erreichen verdünnt und dann mit Sekundenkleber und ein Deckglas zu überlagern: 1) für Steifigkeit, 2) zu verhindern Knochenwachstum und 3) zu reduzieren Lichtstreuung von Unregelmäßigkeiten auf der Knochenoberfläche. Da der Schädel nicht verletzt ist, wird jede Entzündung, die den Prozess beeinflussen könnten, untersucht stark reduziert. Imaging Tiefen von bis zu 250 mu m unterhalb der kortikalen Oberfläche kann mit Hilfe der Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie werden. Dieses Fenster eignet sich gut zur Hirndurchblutung und zelluläre Funktion in beide betäubt und wach Vorbereitungen zu studieren. Es bietet darüber hinaus den OPPortunity zu manipulieren Zellaktivität mit Optogenetik oder um den Blutfluss in ausgewählten Behältern durch Bestrahlung der zirkulierenden Photosensibilisatoren stören.

Protocol

1. Vorbereitung für Chirurgie I Reinigen Sie die chirurgischen Instrumente im Ultraschallbad in einer Mischung aus Maxizyme und Chirurgische Milch in einem Ultraschallreiniger. Autoklavieren chirurgische Instrumente vor jedem Experiment. Stellen Sie sicher, dass alle notwendigen Reagenzien und Verbrauchsmaterial zur Verfügung stehen. Eine Liste von Reagenzien und Verbrauchsmaterial ist in Tabelle 2 bereitgestellt. Reagenzien und Einwegartikel, die in Kontakt mit dem freiliegenden Gewebe…

Discussion

Zwei-Photonen-Bildgebung durch eine Ports Fenster erfordert die Übertragung durch den ausgedünnten Knochen und Dura, welches das Laserlicht dämpft und fügt optischen Aberrationen in größeren Tiefen 8. Doch trotz dieses Nachteils kann bildgebenden Tiefen bis zu 250 mu m unterhalb der Pia-Oberfläche mit 900 nm Anregung erreicht werden. Größere Tiefen Bildgebung kann im Prinzip möglich sein, mit mehr Anregungswellenlängen 13. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode ist das Fehlen von kortik…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (Postdoc-Stipendium an AYS) und der National Institutes of Health (MH085499, EB003832 und OD006831 zu DK) unterstützt. Wir bedanken uns bei Beth Friedman und Pablo Blinder für Anmerkungen zum Manuskript.

Materials

Agent Route of delivery Dose for mouse Duration Notes Source Ref Ref
Pentobarbital (Nembutal) IP 90 μg/g 15-60 min Narrow safety margin. Work up to proper dose of anesthesia slowly. Supplement 10 % of induction dose as required. 036093; Butler Schein 7
Ketamine (Ketaset) mixed with Xylazine (Anased) IP 60 μg/g (K)
10 μg/g (X) (mix in same syringe)
20-30 min Xylazine is co-injected as a muscle relaxant and analgesic. Supplement only Ketamine at 50% of induction dose as required. (K) 010177, (X) 033198; Butler Schein 7
Isoflurane (Isothesia) Inhalation 4% mean alveolar concentration (MAC) for induction; 1-2% MAC for maintenance 4-6 h. Provided in mixture of 70% oxygen and 30% nitrous oxide. Prolonged anesthesia leads to slow recovery. 029403; Butler Schein 26

Table 1. Suggested anesthetic agents for survival studies.

ITEM COMPANY CATALOG # / MODEL
Betadine Butler Schein 6906950
Buprenorphine (Buprenex) Butler Schein 031919
Fluorescein isothiocyanate dextran, 2 MDa molecular weight Sigma FD2000S
Isopropyl alcohol Fisher AC42383-0010
Lactated Ringer’s Solution Butler Schein 009846;
Lidocaine solution, 2 % (v/v) Butler Schein 002468
Saline Butler Schein 009861
Surgical Milk Butler Schein 014325
Texas Red dextran, 70 kDa molecular weight Invitrogen D1864
Maxizyme Butler Schein 035646
DISPOSABLES
Carbide burrs, 1/2 mm tip size Fine Science Tools 19007-05
Cottoned tip applicators Fisher Scientific 23-400-100
Cover Glass, no. 0 thickness Thomas Scientific 6661B40
Cyanoacrylate glue ND Industries 31428 H04308
Gas duster Newegg N82E16848043429
Grip cement powder Dentsply 675571
Grip cement solvent Dentsply 675572
Insulin syringe, 0.3 mL volume with 29.5 gauge needle Butler Schein 018384
Nut and bolt to secure the head Digikey Nut, H723-ND; bolt, R2-56X1/4-ND
Opthalmic ointment Butler Schein 039886
Scalpel blades Fisher Scientific 12-460-448
Screws, self-tapping #000 J.I. Morris Company FF000CE125
Silicone aquarium sealant Perfecto Manufacturing 31001
Tin oxide powder Mama’s Minerals EQT-TINOX
EQUIPMENT
Glass scribe Fisher Scientific 08-675
Dissecting microscope Carl Zeiss OPMI-1 FC
Electric powered drill Foredom or Osada K.1020 (Foredom) or EXL-M40 (Osada)
Electrical razor Wahl Series 8900
Forceps, Dumont no. 55 Fine Science Tools 11255-20
Feedback regulated heat pad FHC 40-90-8 (rectal thermistor, 40-90-5D-02; heat pad, 40-90-2-07)
Isoflurane vaporizer Ohmeda IsoTec4
Pulse oximeter Starr Life Sciences MouseOx
Screwdriver, miniature Garret Wade 26B09.01
Stereotaxic frame Kopf Instruments Model 900 (with mouse anesthesia mask and non-rupture ear bars)
Surgical scissors, blunt end Fine Science Tools 14078-10
Ultrasonic cleaner Fisher Scientific 15-335-30

Table 2. List of specific reagents, disposables and equipment.

Referenzen

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Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (61), e3742, doi:10.3791/3742 (2012).

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