Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחים (דגי 3D החיסוני DNA) 3D.
Abstract
פלורסנט כלאה באתר באמצעות בדיקות DNA על 3-ממדי גרעינים נשמרו אחרי מיקרוסקופיה confocal 3D (דגי DNA 3D) מייצג את הדרך הישירה ביותר כדי לחזות את המיקום של לוקוסים גנטיים, כרומוזומלית תתי אזורים או שטחים שלמים בתאים בודדים. סוג זה של ניתוח מספק תובנה הארכיטקטורה העולמית של הגרעין, כמו גם את ההתנהגות של לוקוסים הגנומי ספציפיים ואזורים בתוך השטח הגרעיני. Immunofluorescence, לעומת זאת, מאפשר זיהוי של חלבונים גרעיניים (ההיסטונים שונים, משתנה ומכפילי היסטון, מכונות וגורמי שעתוק, תת תאים גרעיניים, וכו '). האתגר הגדול בשילוב דגי DNA immunofluorescence ו3D הוא, מצד אחד לשמר epitope זוהה על ידי הנוגדן כמו גם ארכיטקטורת 3D של הגרעין, ומצד שני, על מנת לאפשר את החדירה של הבדיקה DNA כדי לזהות לוקוסים גנטיים או טריטוריות כרומוזום 1-5. כאן אנו מספקים פרוטוקול שמשלב הדמיה של שינויי הכרומטין עם לוקוסים הגנומי גרעינים נשמרו 3D.
Introduction
מנגנוני ממסד epigenetic הדק וירושה של פרופילי תעתיק ספציפיים התפתחותיים ותא מסוג. ברמה אחת זה כרוך אפנון של אריזת הכרומטין שמגדירה אזורים גנטיים פעילים או שקטים. בקנה מידה גדול יותר, ארגון 3D הגלובלי של הגנום גרעיני והאדריכלות גם לשחק תפקיד בשליטה על דפוסי תעתיק. לפיכך, נתיחה של תכונות epigenomic אלה חיוני להבנה מלאה של איך גנים מוסדרים 6-11.
שילוב דגי DNA immunofluorescence ו3D מספקים הזדמנות ייחודית כדי להשלים ניתוחים מולקולריים והביוכימי ידי הערכת אינטראקציות / עמותות של רצפי DNA ו / או חלבונים בתוך הגרעין ספציפיות. יתר על כן, אילו טכניקות תפוקה גבוהה הגנום כגון הכרומטין immunoprecipitation (שבב ואילך) או קונפורמציה לכידת כרומוזום בשילוב עם רצף עמוק (4C-seq, 5C, Hi-C) מספקות dat הגלובליעל אוכלוסיות תאים 12, טכניקות דגי immunofluorescence / דנ"א לאפשר ניתוחים ברמת התא הבודדה.
כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחי 3D (חיסוני דגי 3D). היתרון של פרוטוקול זה הוא ההדמיה המשולבת של דנ"א ושימור של מבנים חלבוניים. הניסיון שלנו בתחום זה אפשר לנו לשפר ולפשט את פרוטוקולים קיימים. למרות שיש לנו להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות הפסקות גדילי הדנ"א כפולים בהלימפוציטים עוברים רקומבינציה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על חלבונים אחרים וסוגי תאים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הטכניקות המפורטות לעיל שמשו במעבדה שלנו לנתח את הרגולציה של רקומבינציה V (D) J של אימונוגלובולין ולוקוסי TCRA / ד בפיתוח לימפוציטים 30,31. אנו בטוחים כי טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לזיהוי של חלבונים שונים גרעיניים, תאים גרעיניים ולוקוסים, בסוגי תאים שונים. ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לחברי Skok המעבדה, במיוחד סוזנה יואיט, לדיונים והערות. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקי R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS הוא לוקמיה ולימפומה חוקר חברה. JC הוא עמית אירווינגטון מכון לחקר הסרטן. MM נתמך על ידי קרן לאומי למדע חינוך גרנט אינטגרטיבית בוגר והמחקר Traineeship (NSF IGERT 0333389).
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. |
Referenzen
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories–a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus – charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3′ Igk enhancer induces ‘decontraction’ of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus ‘decontraction’ and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
